第 1 章讨论了如何把巨大的基因组 DNA 切割、克隆并组织为物理图谱；下一步的问题是：每一段 DNA 中四种碱基（A、C、G、T）的精确排列顺序是什么。测序(DNA sequencing)就是对这一问题给出逐碱基答案的过程。人类基因组约 3.1×10⁹ bp，只有当测序本身足够准确、可重复且能规模化运行时，逐碱基地读出这样一部“天书”才具备现实可行性（Gibson & Muse, 2009）。
在长达四分之一个世纪的时间里，这一任务的标准答案由 Frederick Sanger 及其同事于 1977 年确立的双脱氧链终止法(dideoxy chain-termination method)给出（Sanger et al., 1977）。该方法的构思颇为迂回：并不设法“直接观察”碱基本身，而是让 DNA 聚合酶以模板为指导逐个添加核苷酸，再用一类经过改造的“缺陷”底物使合成反应在随机位置停下——于是，片段的长度本身就携带了碱基所处的位置信息。本节依次讨论其反应化学、读出方式的技术演进、碱基质量值体系、读长与通量的物理约束，以及它的历史定位与局限。
2.1.1 链终止化学：一个羟基的缺失
一个典型的测序反应体系含有四类组分：单链 DNA 模板、与模板互补的短引物(primer)、DNA 聚合酶，以及四种正常的脱氧核苷三磷酸(dNTP)与四种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)的混合物。反应的第一步是引物退火：引物与模板特定区段按碱基互补配对结合，为聚合酶提供一个游离的 3′-羟基起点。随后聚合酶自该起点沿模板以 5′→3′ 方向延伸：每一个新掺入的核苷酸以其 5′-三磷酸与上一核苷酸的 3′-羟基缩合，形成磷酸二酯键并释放焦磷酸。这一化学过程与体内 DNA 复制无异；测序的全部巧思在于底物的“掺杂”。
ddNTP 与对应 dNTP 的结构几乎完全相同，唯一的关键差别在核糖的 3′ 位：dNTP 的 3′ 碳上带有羟基（3′-OH），ddNTP 的 3′ 碳上则只有一个氢原子（图 2.1-1A）。聚合酶在选择底物时依据的是碱基配对与 5′-三磷酸结构，对 3′ 位的这一改动并不敏感，因而会以一定概率把 ddNTP 当作正常底物掺入新链。然而一旦掺入，这条链的末端就不再有 3′-羟基，下一个磷酸二酯键无从形成——链的延伸就此不可逆地终止于这个 ddNTP 之上（图 2.1-1B）。
由于终止是随机的、逐位点竞争的，一个反应管中数以万亿计的模板分子会同步复制，产生一套从引物之后第一个位置起、长度逐一递增的片段家族：若反应中掺有的是 ddATP，则每个片段的末端都是 ddA，且其长度直接指出“链在第几个核苷酸处终止”。按式（2.1-1）的简化讨论，单个位点掺入 ddNTP 的概率 p 由两类底物的浓度比决定，链终止前的延伸长度近似服从几何分布。
这一公式揭示了实验设计的核心权衡：ddNTP 比例过高，则 p 大、多数链过早终止，长片段缺失；比例过低，则长片段虽有但数量稀少、信号微弱，短片段过剩。测序试剂的配方即围绕这一权衡优化，使片段长度分布覆盖数百至上千核苷酸的窗口（详见 2.1.4）。在 Sanger 与 Coulson（1975）早年的“加减法”中，序列读取依赖合成与降解两套反应的对照；链终止法以单一的竞争性掺入机制取代了这一繁琐方案，是其在工程上胜出的关键（Sanger et al., 1977）。
习题 2.1-1
某测序反应中 ddATP 与 dATP 的摩尔浓度之比为 1∶600（其余三种碱基比例类似）。(1) 按式 (2.1-1) 的简化假设，估计 A 位点的终止概率 p 与平均延伸长度；(2) 计算一条新链在遇到第一个 ddNTP 之前延伸超过 500 个核苷酸的概率；(3) 说明为何实测的有效读长分布比该几何模型预测的更早截断。
参考解答(1) p = 1/(600+1) ≈ 1.66×10⁻³，E(L) = 1/p ≈ 601 nt。(2) P(L > 500) = (1−p)⁵⁰⁰ ≈ e^(−500/601) ≈ e^(−0.832) ≈ 0.435，即约 44% 的链可越过 500 nt。(3) 模型假设各 A 位点独立同分布且酶不歧视 ddNTP；实际聚合酶对不同碱基与序列情境的掺入效率存在偏好，链还会因聚合酶脱落、模板二级结构等原因非终止性中断，更重要的上限来自电泳分辨率与末端信号衰减——超过一定长度后峰无法逐碱基分辨，有效读长由此被物理截断。
2.1.2 读出方式的演进：从四泳道放射自显影到毛细管电泳阵列
有了片段家族，剩下的问题是“读出”。1977 年的原初方案采用四个平行反应：分别掺入 ddA、ddC、ddG、ddT，以放射性同位素（如 ³²P）标记新合成链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上分四个泳道电泳，再经放射自显影在 X 光片上显带。读序者从胶片下方（最短片段）向上逐带比对四条泳道，手工记录每个位置的碱基字母。这一方式受限于三重噪声：泳道间迁移速率的系统性差异、胶片颗粒度，以及人眼的判读疲劳，单块凝胶通常只能可靠读取约一两百个碱基（估计值），且高度依赖操作者技能（Sanger et al., 1977）。
自动化的第一步是以光代射线。Smith 等（1986）提出以四种光谱可区分的荧光染料分别标记四条反应的引物（染料引物，dye primer），四种反应产物混合后在同一泳道电泳；凝胶底部设固定检测窗，激光依次激发越过窗口的每个荧光片段，探测器按颜色判定其归属于哪个反应。单泳道方案从根本上消除了泳道间迁移差异这一误差源，且数据以数字信号实时采集，读出的不再是胶片而是一条随时间变化的四通道荧光强度曲线——色谱图(chromatogram / trace)。Prober 等（1987）进一步把染料从引物转移到 ddNTP 本身，构成染料终止子(dye terminator)：四种 ddNTP 各带一种染料，一个反应管即可完成全部四种终止反应，片段的颜色直接标明其末端碱基。染料终止子免去了四管分别操作的繁琐，与自动化加样和热循环程序天然兼容，成为此后毛细管测序的标准化学。
第二步是以管代胶。毛细管电泳(capillary electrophoresis)以内径数十微米的石英毛细管灌充线性聚合物作为分离介质替代平板凝胶：毛细管散热面积大，可承受高得多的电场强度，分离在 2–3 小时内完成；无需手工灌胶、撕胶，且各管迁移条件高度一致。将几十至几百根毛细管排成阵列、配以自动进样器与 96 孔板机器人，测序便从“作坊”进入“工厂”：以 96 道阵列机型（如 AB 3730xl 一类）为主力，一次运行同时读 96 条序列，亦有 384 道机型用于更大规模中心。人类基因组计划后期的各大测序中心即以数十台此类仪器昼夜运转，配合实验室信息管理系统实现工业化的“模板进、序列出”（Gibson & Muse, 2009）。
从色谱峰到碱基：base-calling。测序仪输出的原始数据是四通道荧光强度随时间的采样序列，把峰列翻译成碱基列的计算过程称为碱基识别(base-calling)，以 Phred 程序最为经典（Ewing et al., 1998；Ewing & Green, 1998）。其大致流程为：
- 预处理：扣除基线与噪声，校正四种染料各自的迁移偏移（mobility shift）——不同染料对片段迁移的影响略有差异，须逐一标定补偿，否则峰位会系统性错位；
- 峰位预测：峰间距在理想情况下近似恒定，程序以滑动窗口拟合局部周期模型，预测每个碱基峰应当出现的位置；
- 碱基判读：在预测位置比较四个通道的峰面积与峰形，取信号最优者为该位碱基，并记录次强通道的相对幅度；
- 质量评估：把峰面积比、峰间距偏差、局部分辨率等参数代入经已知序列训练得到的统计模型，换算出每一位碱基的错误概率（见 2.1.3）。
最终输出为两行并列的信息：碱基序列，以及与之逐位对应的整数质量值。后续一切分析——拼装、比对、提交数据库——都以这两行数据为起点。
2.1.3 质量值体系：给每个碱基一个可信度
自动读出的序列并非每个字母都同等可靠：峰形弥散、双峰交叠、末端信号衰减都会使判读出错。人类基因组计划时代的一项基础性贡献，是 Green 实验室的 Phred 程序为每一个碱基给出量化的错误概率，并将其压缩为整数质量值(quality score)（Ewing et al., 1998；Ewing & Green, 1998）：
图 2.1-2 概括了质量值在实践中的用法：高质量区段峰形尖锐、单色、间距均匀，Q 值稳定在 30 以上；一旦出现双峰或峰形压缩，Q 值随即坍落，提示该位需要复核或重测。质量值由此成为整个下游流程的“通用货币”：拼装程序以 Q 值为权重对重叠区碱基投票，一致性序列在低 Q 位置被自动标记为待审校，测序中心也常以“Q20 碱基数”统计有效产出。与 Phred 同源的软件生态还包括拼装器 Phrap 与图形化审校工具 Consed（Gordon et al., 1998），三者构成从 trace 到完成序列的经典流水线，其“每个碱基自带可信度”的数据观贯穿了此后的 NGS 时代。
读色谱图的四个要点。在 Consed、FinchTV 一类查看软件中检查 trace 时，应注意：
- 峰形与间距：峰过宽、间距忽大忽小（压缩），常提示单链二级结构导致迁移异常，该区段碱基顺序可能有误；
- 双峰交叠：同一位置两个通道同时出峰，可能是杂合位点（两条同源染色体各贡献一个信号）、样品污染或嵌合模板，也可能只是噪声——应结合 Q 值与生物学情境判断，勿一概视为错误；
- 两端低质量：读段开头数十碱基受引物峰干扰、末端信号衰减，Q 值曲线两头低中间高，常规可靠区约在 30–700 bp 之间；
- 通道串扰：一个通道的峰会向相邻通道“漏光”，成熟的 base-caller 已做光谱补偿，人工读图时应以校正后的峰与 Q 值条为准。
经验法则是：相信峰，但更相信 Q 值；单一尖锐峰且 Q ≥ 30 者可直接使用，双峰且 Q < 20 者须存疑，必要时以另一条链或反向引物重测确认。
习题 2.1-2
(1) Q 值为 20、30、40 的碱基，其判读错误率各是多少？(2) 一条 700 bp 的读段若全部碱基平均质量为 Q30，期望错误数是多少？平均 Q20 呢？(3) 两个碱基的 Q 值相差 10，错误率相差几倍？相差 12 呢？
参考解答(1) 由 Pe = 10^(−Q/10)：Q20 → 10⁻² = 1%；Q30 → 10⁻³ = 0.1%；Q40 → 10⁻⁴ = 0.01%。(2) Q30：700 × 10⁻³ = 0.7 个期望错误；Q20：700 × 10⁻² = 7 个——平均质量下降 10，期望错误数增至 10 倍，故“差 10”在对数刻度上是一个数量级的差距。(3) 相差 10 → 错误率之比 10^(10/10) = 10 倍；相差 12 → 10^(12/10) ≈ 15.8 倍。
2.1.4 读长与通量的物理约束
读长（read length）：单条读段（read）自起点起能够被可靠判读的碱基数目。它由两个更基本的量共同决定：其一为化学读长，即链终止反应实际产生的可用片段长度分布（受 ddNTP/dNTP 比例与聚合酶特性约束，见式 2.1-1）；其二为分离读长，即电泳系统仍能把长度相差 1 nt 的片段逐一分辨开来的最大长度。有效读长取二者的下限，常以 Q20 或 Q30 碱基数计。
Sanger 测序的读长上限首先来自物理而非化学。电泳分离要求把长度相差仅 1 nt 的片段区分开来，而片段越长，相邻长度间的迁移率差越小，峰形又被扩散与进样宽度逐渐涂抹，最终相邻峰合并、无法逐碱基判读。平板凝胶的有效分离大体止于 500 bp 左右；加长毛细管、优化聚合物与温度程序可把这一极限推至 800–1 000 bp，但代价是更长的运行时间与更苛刻的仪器稳定性。其次的约束来自化学与信号：几何分布意味着长片段分子稀少，末端荧光信号随之衰减；模板的二级结构会造成迁移“压缩”，使局部峰序错位；读段起始端又受引物峰干扰。综合之下，常规送样读长约 650–850 bp，属经验上的稳健区间（Gibson & Muse, 2009）。
在通量端，Sanger 体系的扩展方式本质上是线性的：更快的运行、更多道毛细管、更多台仪器与更多操作人员。以人类基因组计划主力阶段的 96 道毛细管机型为例，一次 2–3 小时的运行产出 96 条读段、合计约 0.06–0.08 Mb；计入前后处理与质控，单台仪器日通量约在 0.5–1 Mb 量级（量级估计）。各大测序中心以数十至上百台仪器并行、辅以工业化的模板制备与信息系统，才把年通量推进到数十 Gb 的规模。表 2.1-1 汇总了这一体系的关键指标与制约因素。
| 指标 | 典型量级 | 主要制约 |
|---|---|---|
| 有效读长 | 约 500–1 000 bp（常规 650–850 bp） | 电泳分辨率、峰形弥散与信号衰减 |
| 单条读段产出 | 约 600–800 个 Q20 碱基 | 式 (2.1-1) 的比例权衡与末端衰减 |
| 单次运行产出 | 96 道 × 约 0.7 kb ≈ 0.06–0.08 Mb | 毛细管阵列规模 |
| 单台日通量 | 约 0.5–1 Mb（量级估计） | 运行时长、自动化与前后处理 |
| 原始准确率 | 约 99.9%（高质量区段 Q ≥ 30） | 化学副反应、压缩与判读歧义 |
| 完成图准确率 | ≥ 99.99%（每 10 kb 少于 1 个错误） | 依赖多重覆盖与人工审校（见 2.4 节） |
注：表中数值为教学用量级概括，随仪器型号、化学版本与时期而变；原书出版于 2009 年，彼时 NGS 平台已开始分担大规模生产任务，但完成图与验证阶段仍以 Sanger 为准绳。
2.1.5 历史定位与局限
链终止法并非凭空出现。Sanger 与 Coulson（1975）先以“加减法”实现了引物合成的序列测定，但需两套平行反应且错误率偏高；1977 年改用双脱氧核苷酸作为链终止抑制剂后，原理与流程一举定型（Sanger et al., 1977）。同年，Maxam 与 Gilbert（1977）发表了基于化学降解的另一条测序路线：以特异性试剂在 A+G、C+T、C 等碱基处切割末端标记的 DNA 片段，同样按片段长度读序。两种方法在随后数年并行发展，但化学降解法无需聚合酶与单链模板的优势，终究敌不过链终止法在反应酶学与自动化上的延展性——随着工程化聚合酶、荧光化学与毛细管仪器相继成熟，Sanger 路线于二十世纪九十年代成为绝对主流。历史常被忽略的一个细节是：Sanger 研究组次年即以该方法完成了噬菌体 φX174 全长 5 386 nt 的序列，这也是第一个被完整测定序列的“基因组”。
1980 年，Sanger 与 Walter Gilbert 因核酸测序分享诺贝尔化学奖的一半，另一半授予重组 DNA 技术的开创者 Paul Berg。这是 Sanger 第二次获奖——1958 年他已因胰岛素一级结构的测定获同一奖项，成为极少数两度获诺贝尔奖的科学家之一。对基因组科学而言，1977 年这两篇方法学论文的意义或许不亚于任何一次概念突破：它们把“读出序列”从数年的手工劳动压缩为数天的例行程序，为此后一切基因组计划提供了可复制的工艺起点。
Sanger 试剂的标准化与测序商业化。链终止法从手工作坊走向工业流水线，靠的不是单一发明，而是一整套试剂与工艺的持续标准化。早期实验室须自行纯化 Klenow 大片段、自配 ddNTP 混合物，反应只能覆盖数十至百余碱基；商品化试剂盒随即出现——噬菌体 T7 来源的 Sequenase 等工程化聚合酶提高了延伸能力与均一性；耐热聚合酶的引入催生循环测序(cycle sequencing)：以线性 PCR 式的重复变性—退火—延伸从极少量模板累积信号，使测序与 PCR 体系共用仪器，并显著降低模板用量。降低 ddNTP 掺入歧视的突变聚合酶（如 Thermo Sequenase 一类）改善了终止分布的均一性；四色染料终止子化学（Prober et al., 1987）最终定型为集成式预混试剂，配合 96 孔板、条码化样品与质控规程，使“送样测序”成为任何分子生物学实验室都可购买的常规服务。Applied Biosystems 等厂商围绕仪器、试剂与软件构成的封闭体系，则塑造了此后二十年基因组测序的基础设施格局。
进入二十一世纪，Sanger 体系的局限在“巨基因组”面前日益凸显：通量与毛细管数目成正比，无法像芯片那样借表面并行度指数扩张；每条读段的试剂与人力成本存在刚性下限；读长受电泳物理的硬约束。对 3.1 Gb 的人类基因组而言，即便按 6–8 倍覆盖估算也需数千万条读段，任何以“毛细管数目 × 仪器台数”为变量的扩张方式在成本上都难以为继。这正是新一代测序（NGS）兴起的直接动因：以牺牲单次反应的读长与某些情形下的准确率，换取百万至亿量级的并行反应数。需要强调的是，Sanger 方法并未就此退场——在 2.3 节讨论的拼装收尾、2.4 节的缺口填补，以及此后的变异验证、小基因组测序与条码鉴定中，长读段、高准确率的 Sanger 数据长期保持着参考方法的地位。技术的演进逻辑由 2.2 节展开。
关键术语
- 双脱氧核苷酸 (ddNTP)
- 3′ 位（及 2′ 位）不含羟基的核苷三磷酸类似物，被聚合酶掺入后使链延伸不可逆终止。
- 链终止 (chain termination)
- ddNTP 掺入导致聚合反应停止的机制，由此产生末端碱基固定、长度各异的片段家族。
- 引物 (primer)
- 与模板互补结合的短寡核苷酸，为聚合酶提供带 3′-OH 的延伸起点。
- 读长 (read length)
- 单条读段可被可靠判读的碱基数，取化学读长与分离读长的下限。
- 碱基识别 (base-calling)
- 从四通道色谱轨迹推断碱基序列及其逐位错误概率的计算过程。
- 质量值 (quality score, Q)
- 碱基判错概率的对数标度度量，Q = −10·log₁₀(Pe)。
- 色谱图 (chromatogram / trace)
- 测序仪记录的四通道荧光强度随洗脱时间变化的原始数据。
- 染料终止子 (dye terminator)
- 自身携带荧光染料的 ddNTP，使四种终止反应可在单管单泳道中完成。
- 毛细管电泳 (capillary electrophoresis)
- 以聚合物填充毛细管为介质按片段大小分离 DNA 的技术，可组成多道阵列自动化运行。
- 循环测序 (cycle sequencing)
- 用热稳定聚合酶经重复热循环线性扩增测序产物的 Sanger 反应程序。
参考文献与延伸阅读
- Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463–5467.
- Sanger F, Coulson AR. 1975. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology 94: 441–448.
- Maxam AM, Gilbert W. 1977. A new method for sequencing DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 560–564.
- Smith LM, Sanders JZ, Kaiser RJ, et al. 1986. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature 321: 674–679.
- Prober JM, Trainor GL, Dam RJ, et al. 1987. A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides. Science 238: 336–343.
- Ewing B, Hillier L, Wendl MC, Green P. 1998. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research 8: 175–185.
- Ewing B, Green P. 1998. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research 8: 186–194.
- Gordon D, Abajian C, Green P. 1998. Consed: a graphical tool for sequence finishing. Genome Research 8: 195–202.
- Gibson G, Muse SV. 2009. A Primer of Genome Science, 3rd ed. Sunderland (MA): Sinauer Associates. (Chapter 2)