3.2 节讨论了如何发现变异并逐一读取基因型：对给定个体、给定位点，判定其纯合或杂合状态。但基因组并非孤立位点的集合：同一条染色体上的等位基因在世代传递中结伴而行，构成特定的组合。本节把视角从"单个位点"提升到"一条染色体上的多个位点"，引入两个相互缠绕的概念——描述这种组合的单倍型，与度量组合非随机程度的连锁不平衡；随后说明 LD 从何而来、如何在基因组上组织成单体型块、如何被国际 HapMap 计划编目并压缩为数十万个标签 SNP，以及它对疾病等基因定位的帮助与困扰。这些内容是理解 3.5 节全基因组关联研究可行性的直接前提（Gibson & Muse, 2009, Chapter 3）。
3.3.1 单倍型与相位问题
单倍型(haplotype)（又译单体型）指同一条染色体上一组位点上等位基因的组合。设某区段内有三个相邻 SNP，等位基因分别为 A/a、G/g、C/c，则 AGC、Agc、aGC 等都是可能的单倍型；每位点均为杂合的个体，其两条同源染色体各携带其中一条。单倍型是 LD 分析的基本计数单位——然而常规基因分型输出的却是"每个位点的基因型"，例如"位点 1 为 A/a，位点 2 为 B/b"，它并不说明 A 与 B 是否位于同一条染色体之上。
以双杂合个体为例，其两条同源染色体只有两种可能的组织方式（表 3.3-1）。两种定相对应的单倍型组合完全不同，而任何仅基于这两个位点基因型的观测都无法区分二者。
| 定相方式 | 两条同源染色体上的单倍型 | 含义 |
|---|---|---|
| 顺式（耦合，coupling） | AB 与 ab | A 与 B 在同一条染色体上 |
| 反式（互斥，repulsion） | Ab 与 aB | A 与 b 在同一条染色体上 |
相位问题。二倍体个体的基因型是两条同源染色体上两条单倍型的无序组合，而常规分型只给出各位点不区分来源的等位基因集合。等位基因沿两条同源染色体的归属称为相位(phase)，由基因型数据恢复相位的过程称为定相(phasing)。在 k 个杂合位点上，一份基因型对应 2k−1 种可能的单倍型对；基因型到单倍型是多对一映射，故相位原则上不能由单个个体的常规基因型唯一确定。相应地，D′ 与 r² 等 LD 统计量所需的单倍型频率，在相位未知时须经统计推断间接获得。
定相的三类策略。(1) 家系定相：利用亲子基因型的传递约束——当配偶在相应位点为纯合时，子代从杂合亲本得到的等位基因可直接读出，一个孩子往往即可锁定其相位（习题 3.3-1）。(2) 实验定相：对克隆来源的片段、单条染色体或长读长测序，读段横跨多个杂合位点，相位直接可读。(3) 统计定相：Clark（1990）的推断算法先从纯合与单杂合个体读出无歧义单倍型，再以其解释双杂合个体；EM 与极大似然法则把单倍型频率当作未知参数，寻求最能解释全体观测基因型的频率配置（Excoffier & Slatkin, 1995）。其核心思想可以概括为一句话：凡能产生观测基因型的各种单倍型组合之中，按群体频率加权最可能者即为估计。现代流程通常将三类信息与千人基因组等参考单倍型面板联合使用，并与下文的基因型插补互为表里。
单倍型层面的非随机性正是接下来的主题。需要指出，LD 的估计与定相在计算上相互依赖：群体中存在强 LD 时，统计定相更可靠；反之，可靠的单倍型频率又是计算 LD 统计量的输入。二者的联合推断是群体基因组学中一个标准的统计课题。
习题 3.3-1
某个体在两个位点上均为杂合（A/a；B/b）。(1) 写出两种可能的定相及对应的单倍型组合。(2) 若让其与另一位在两位点均为纯合（a/a；b/b）的个体杂交，观察一个孩子即可定相，为什么？(3) 若无家系信息，仅知群体单倍型频率 f(AB) = 0.42、f(Ab) = 0.18、f(aB) = 0.08、f(ab) = 0.32（表 3.3-2），统计定相应如何比较两种相位的可能性？
参考解答(1) 顺式：单倍型对 AB/ab；反式：单倍型对 Ab/aB。(2) 纯合配偶只能提供 ab，孩子在这两个位点上从杂合亲本获得的等位基因即为孩子基因型中除去 ab 之外的部分：孩子为 A/a、B/b 说明亲本传给其 AB（支持顺式）；孩子为 A/a、b/b 说明传给其 Ab（支持反式）。因此一个孩子即可区分两种相位。(3) 两种相位下观测到该基因型的概率分别正比于 f(AB)·f(ab) = 0.42×0.32 = 0.1344 与 f(Ab)·f(aB) = 0.18×0.08 = 0.0144；顺式的似然约为反式的 9.3 倍，归一化后顺式概率约 0.90、反式约 0.10。这正是极大似然定相的简化版：取使观测数据似然最大的相位。
3.3.2 连锁不平衡的度量
考虑群体中两个双等位位点，等位基因分别为 A/a 与 B/b，单倍型有 AB、Ab、aB、ab 四种，频率记为 pAB、pAb、paB、pab。若两位点的等位基因在形成配子时随机组合，任一单倍型的频率应等于相应等位基因频率之积，例如 pAB = pA·pB。对这一独立性的系统性偏离称为连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)；D = 0 的情形相应地称为连锁平衡。最基本的 LD 度量是不平衡系数 D（Lewontin, 1964）：
D 的绝对大小依赖等位基因频率，不便于在不同位点对之间比较，因此有两个标准的标准化版本。其一为 Lewontin 提出的标准化系数 D′：
其二为两位点等位指示变量（0/1 编码）间相关系数的平方 r²：
数值例（手算）。表 3.3-2 给出某群体中两个常见 SNP 的单倍型频率估计。
| 单倍型 | 观测频率 | 独立期望（等位频率之积） |
|---|---|---|
| AB | 0.42 | 0.60 × 0.50 = 0.30 |
| Ab | 0.18 | 0.60 × 0.50 = 0.30 |
| aB | 0.08 | 0.40 × 0.50 = 0.20 |
| ab | 0.32 | 0.40 × 0.50 = 0.20 |
| 边缘频率 | pA = 0.60，pa = 0.40；pB = 0.50，pb = 0.50 | |
逐步计算如下。先由单倍型频率求边缘：pA = 0.42 + 0.18 = 0.60，pB = 0.42 + 0.08 = 0.50。按式 (3.3-1)，D = 0.42 − 0.60×0.50 = 0.12。D > 0，故 Dmax = min(0.60×0.50, 0.40×0.50) = 0.20，按式 (3.3-2) 得 D′ = 0.12/0.20 = 0.60。按式 (3.3-3)，r² = 0.12²/(0.60×0.40×0.50×0.50) = 0.0144/0.0600 = 0.24。若把四个频率排成 2×2 列联表做独立性检验，χ² = N·r²：N = 200 条染色体时 χ² = 48，远超自由度 1 的常用阈值——两位点确有可检测的 LD；但 r² = 0.24 同时说明以一者代理另一者并不划算（样本量约需放大 1/0.24 ≈ 4.2 倍）。读者可在下方演示中改动输入，观察各统计量的联动。
输入四个单倍型频率（0 至 1，总和须为 1），即时计算边缘等位频率、D、D′ 与 r² 并给出判读；可用于验证表 3.3-2 与习题 3.3-2 的手算结果。
D′ 与 r² 的性质差异在实践中至关重要。D′ 对稀有等位与零计数极为敏感：只要四种单倍型中有一种观测频率为 0（单侧零计数，在低频变异或小样本中极易偶然出现），D′ 即取 ±1，呈现"完全 LD"的表象，而此时两位点的相关性可以很低。r² 则同时惩罚频率失配与相位混合：它的数值直接回答"两位点共享多少信息"。因此，刻画重组历史与块边界常用 D′，而回答"能否互相替代"一律用 r²。
何时用 D′，何时用 r²。两个统计量回答不同的问题。问"这两位点之间是否发生过重组"——用 D′：|D′| = 1 表示存在缺失的单倍型，最简洁的解释是两位点间的关联尚未被重组打破，故 D′ 常用于刻画单体型块结构。问"这个 SNP 能否代替那个 SNP"——用 r²：r² 度量信息共享比例，1/r² 近似给出代理造成的样本量代价，标签 SNP 筛选（常用阈值 r² ≥ 0.8）据此进行。常见的误读是以 D′ = 1 论证"两 SNP 可互相替代"：在稀有等位场合 D′ 几乎必然饱和于 1，而 r² 可能低至接近 0，替代功效损失极大。
习题 3.3-2
某单体型块内两个 SNP 的单倍型频率为 f(AB) = 0.30、f(Ab) = 0.10、f(aB) = 0.00、f(ab) = 0.60。(1) 计算 pA、pB、D、D′ 与 r²。(2) 解释为何 D′ = 1 而 r² < 1。(3) 若致病变异恰在位点 B，用位点 A 做关联检验的样本量代价约为多少？
参考解答(1) pA = 0.30 + 0.10 = 0.40；pB = 0.30 + 0.00 = 0.30。D = 0.30 − 0.40×0.30 = 0.18。Dmax = min(0.40×0.70, 0.60×0.30) = min(0.28, 0.18) = 0.18，故 D′ = 1。r² = 0.18²/(0.40×0.60×0.30×0.70) = 0.0324/0.0504 ≈ 0.643。(2) 单倍型 aB 频率为 0：在 aB 这一类中不存在任何染色体，"完全 LD"只说明历史上未观察到（或未保留）把 A、B 两种等位拆开的重组产物，是单侧零计数的饱和效应；但两位点的等位频率并不相同（0.40 对 0.30），相关不可能达到 1，故 r² < 1。(3) 样本量约放大 1/r² ≈ 1.56 倍。
3.3.3 LD 的群体过程起源
首先澄清一个高频混淆：连锁不等于连锁不平衡。连锁（linkage）是减数分裂层面的遗传学概念，指两位点位于同一条染色体上、重组率 c < 0.5；LD 是群体层面的统计概念，指等位基因组合频率偏离乘积。紧密连锁有利于维持 LD，但连锁的位点可以处于连锁平衡（历史上的关联已被充分重组抹平），不连锁的位点也可以呈现 LD（群体分层、选择与漂变都能造成）。LD 是一本历史的账，重组、突变、瓶颈、选择与漂变都在其上留痕。
在随机交配、无选择、无突变、无漂变的简化假设下，LD 随世代按几何级数衰减——每传一代，只有比例 1 − c 的配子在两位点之间未发生重组：
式 (3.3-4) 表明 LD 是"年轻"的关联：其寿命由重组率决定。这既解释了 LD 随物理距离衰减的普遍规律，也使衰减模式反过来成为估计历史重组率的依据。LD 从何处被制造？新突变一旦产生，必然完全嵌在一条既有单倍型背景之上，与背景上的每个等位基因都处于完全 LD——突变是 LD 之源。奠基者效应与群体瓶颈则把 LD 推向长距离：由少数染色体奠基的群体，基因组上长达数百 kb 乃至 Mb 的区段共享同一祖先单体型，重组尚未来得及将其打碎；人类走出非洲的扩张便是一例，它至今仍塑造着各大洲群体 LD 结构的差异（见 3.3.5）。
重组率本身也并非沿染色体均匀。精子分型实验率先在主要组织相容性复合体区证明，减数分裂交换集中分布于宽度仅 1–2 kb 的重组热点(recombination hotspot)之内，热点之间是重组率低一个量级的"冷区"（Jeffreys et al., 2001）；全基因组分析表明热点在人类基因组上平均每数万碱基出现一个（量级估计）。重组的这种异质性，叠加群体历史，塑造了单体型图计划观察到的单体型块(haplotype block)结构：典型长度约 10–100 kb 的区段内常见单倍型只有两三种、成对 r² 高；跨过热点，LD 陡然跌落（International HapMap Consortium, 2005）。需要说明，"块"是对数据的描述性划分而非严格的普适单元，其边界判定存在多个操作标准；但作为一级近似，块结构直接启发了下一小节的标签策略。图 3.3-1 汇总了本小节的三个经验规律。
习题 3.3-3
设某群体中两位点的初始不平衡 D0 = 0.20，重组率分别为 c = 0.005 与 c = 0.1。(1) c = 0.005 时，100 代后 D 的预期值是多少？(2) c = 0.1 时，至少需多少代 D 才降到初始值的 5% 以下？(3) 用这两个量级说明：为什么奠基者效应造成的长距离 LD 可以存续数百上千年而被检出，而远距离的随机关联迅速消失。
参考解答(1) 按式 (3.3-4)，D100 = 0.20 × 0.995100 ≈ 0.20 × 0.61 ≈ 0.12。(2) 需 0.9t < 0.05，即 t > ln 0.05 / ln 0.9 ≈ 28.4，至少 29 代。(3) 紧密连锁（c 很小）时衰减时间常数 1/|ln(1−c)| 很长，祖先单体型的痕迹可跨越数百上千代仍在群体中可测——这正是奠基者效应与瓶颈留下的长距离 LD 的来源；而 c 较大（如不同染色体或远距位点）时几十代内关联即被重组抹平，只能观察到瞬时的、由漂变造成的微弱随机 LD。人类约 30 年一代，29 代不足千年，与群体遗传学推断的奠基 LD 时间尺度相符。
3.3.4 标签 SNP 与 HapMap 计划
块结构带来一个工程上有力的推论：既然块内常见变异高度冗余，就不必逐个测量。在每个块内挑选少数能与块内其余常见 SNP 达到 r² ≥ 0.8（常用阈值）的位点作为标签 SNP(tag SNP)，即可用约一个数量级更少的标记"覆盖"绝大多数常见变异——把全基因组数百万个已知 SNP 压缩到数十万至一百万个，恰好落在 3.2 节所述高密度芯片的容量之内。这一降维是全基因组关联研究在 2000 年代中期的技术与经费条件下得以可行的关键（图 3.3-2）。
挑选标签需要先知道各群体中"谁与谁处于高 LD"，这超出了任何单一实验室的能力，于是有了国际人类基因组单体型图计划(International HapMap Project)，2002 年启动，对 269 名个体系统分型并描述常见 SNP 的单倍型结构。样本来自四个群体：尼日利亚伊巴丹的约鲁巴人（YRI，30 个父母—孩子三人组）、美国犹他州的欧洲裔居民（CEU，30 个三人组）、北京汉族人群（CHB，45 名无关个体）与东京日本人（JPT，45 名无关个体）。Phase I 图谱于 2005 年发表，描述约 100 万个 SNP 的单倍型结构与重组率景观（International HapMap Consortium, 2005）；2007 年的 Phase II 将分型密度提高到超过 310 万个 SNP。计划的全部数据即时公开，直接决定了此后十余年商业化 GWAS 芯片上的标签组合。（注：HapMap 基于芯片分型，主要覆盖常见变异；2008 年启动的千人基因组计划改用群体规模重测序，把变异目录推向更低频等位并衔接 HapMap 样本，成为新的公共参考底座——1000 Genomes Project Consortium, 2010。）
HapMap：公共变异目录的工程学。HapMap 的贡献与其说是一项科学发现，不如说是一次基础设施工程：它把"测谁、怎么测、测了给谁用"三个工程问题一次性制度化。测谁——按 r² 冗余原则挑选标签，把资源从数百万位点集中到信息量最大的子集；怎么测——以 3.2 节所述高通量基因分型平台对四个群体统一设计、统一质控；给谁用——数据无限制公开，任何实验室可据之设计芯片、选择标签、执行插补与人群匹配。四群体取样的动机正是 3.3.5 将讨论的群体间 LD 差异：标签集合并非跨群体通用。原书出版于 2009 年，其时 HapMap 正处全盛；今日的参考面板已被千人基因组及其后继者取代，但"公共目录 + 冗余压缩 + 免费共享"的工程范式延续至今。
标签之外，参考单倍型面板还催生了基因型插补(genotype imputation)：以参考单倍型为模板，把研究中只直接分型了数十万位点的样本"补全"到目录中的数百万位点，使不同芯片平台、不同研究可以在同一坐标下合并分析。插补的可行性同样建立在 LD 之上——只有相邻位点高度相关，未测位点的基因型才可被可靠推断；而插补的误差，也首先出现在 LD 较弱的区段。
3.3.5 LD 对定位的意义：帮助与困扰
对基因定位而言，LD 首先是一种可以被利用的冗余。若致病变异与某个标签 SNP 处于高 r²，检验该标签在功效意义上即等价于检验致病变异本身——研究者因此不必预先知道变异的位置与功能，只需用数十万个标签把全基因组系统扫描一遍。这是全基因组关联研究（详见 3.5 节）逻辑可行性的基石：不以基因为候选，而以 LD 结构为杠杆，用有限标记间接检验数百万变异。
同一枚硬币的另一面是因果归因的困难。关联信号升高的可能是致病变异本身，也可能是与它处于高 LD 的任何变异——在单体型块内，这些变异在统计上几乎不可区分。因此关联研究定位的是一个区间或一组候选，而非直接给出因果变异；精细定位需要更密的分型与测序、跨群体对比（利用群体间 LD 差异缩小区间）以及功能证据的综合。把"最显著的 SNP"直接当作致病突变来解读，是阅读关联研究结果时最常见的过度推断之一。
LD 结构的群体差异进一步增加了复杂性。非洲群体拥有更古老、更庞大的有效群体历史，重组有更多世代打断单倍型，LD 在更短距离内衰减、块更短更碎；走出非洲的群体经历过严重瓶颈，染色体背景更年轻，LD 延伸更远、块更长（图 3.3-1A；HapMap 四群体的直接对比见 International HapMap Consortium, 2005）。由此产生两点实践后果：其一，在某一群体中挑选的标签未必在另一群体中仍是标签，芯片与研究人群的匹配问题由此而来；其二，群体间 LD 差异反过来成为精细定位的工具——在多个群体中重测同一信号，因果变异应落在各群体 LD 区间的交集之内。群体结构的这些深层原因，将在 3.6 节的群体遗传学框架中展开。
本节建立的概念——单倍型、LD 的度量、单体型块与标签——回答了"变异如何组织、如何被经济地测量"。下一节（3.4）先转向实验体系：在可以设计杂交的模式生物中，定位数量性状基因座的连锁作图如何展开；3.5 节再回到人类群体，把本节的 LD 逻辑推向全基因组关联研究。
关键术语
- 单倍型 (haplotype)
- 同一条染色体上一组位点上等位基因的组合，又译单体型；LD 分析的基本计数单位。
- 相位 (phase)
- 各等位基因沿两条同源染色体的归属；常规基因型不携带相位信息，原则上需额外推断。
- 定相 (phasing)
- 由基因型恢复两条单倍型的过程，途径包括家系信息、实验（克隆或长读段）与统计算法。
- 连锁不平衡 (linkage disequilibrium, LD)
- 群体中不同位点等位基因的非随机组合；单倍型频率偏离等位频率之积。
- 不平衡系数 D (coefficient of LD)
- 观测单倍型频率对独立期望的偏离，D = p(AB) − p(A)p(B)（Lewontin, 1964）。
- 标准化不平衡 D′
- D 与其频率约束下最大值之比；四种单倍型之一缺失时饱和于 ±1，常用于刻画块结构。
- 配对相关 r² (squared correlation)
- 两位点等位指示变量相关系数的平方；度量信息共享比例，与关联检验功效直接相关。
- 单体型块 (haplotype block)
- LD 强、常见单倍型种类少的染色体区段，典型长度约 10–100 kb，边界多为重组热点。
- 重组热点 (recombination hotspot)
- 重组率远高于邻区的窄区（约 1–2 kb），热点处 LD 断裂、单体型块更替。
- 标签 SNP (tag SNP)
- 按 r² 阈值（常用 0.8）代表块内其余常见变异的少数位点，GWAS 降维的基本手段。
- 单体型图计划 (International HapMap Project)
- 2002 年启动的国际合作计划，编目 YRI、CEU、CHB、JPT 等群体常见 SNP 的频率与单倍型结构。
- 基因型插补 (genotype imputation)
- 借助参考单倍型面板推断未直接分型位点的基因型，使不同研究可在同一坐标下合并。
参考文献与延伸阅读
- Lewontin RC. 1964. The interaction of selection and linkage. I. General considerations; heterotic models. Genetics 49: 49–67.
- Hill WG, Robertson A. 1968. Linkage disequilibrium in finite populations. Theoretical and Applied Genetics 38: 226–231.
- Clark AG. 1990. Inference of haplotypes from PCR-amplified samples of diploid populations. Molecular Biology and Evolution 7: 111–122.
- Excoffier L, Slatkin M. 1995. Maximum-likelihood estimation of molecular haplotype frequencies in a diploid population. Molecular Biology and Evolution 12: 921–927.
- Jeffreys AJ, Kauppi L, Neumann R. 2001. Intense and highly localized gene conversion activity in human meiotic crossover hot spots. Nature Genetics 29: 217–222.
- The International HapMap Consortium. 2005. A haplotype map of the human genome. Nature 437: 1299–1320.
- Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. 2005. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics 21: 263–265.
- The 1000 Genomes Project Consortium. 2010. A map of human genome variation from population-scale sequencing. Nature 467: 1061–1073.
- Gibson G, Muse SV. 2009. A Primer of Genome Science, 3rd ed. Sunderland (MA): Sinauer Associates. (Chapter 3)