上一节的聚类与分类都以微阵列数据矩阵为原料，而矩阵的每一行都来自一条预先设计的探针——杂交式测量天生测不到未知的基因与剪接体。本节介绍先于 RNA 测序登场的另一条路线：不杂交、不用探针，直接从每个转录本上截取一小段“标签”序列，数标签的个数。基因表达序列分析（SAGE）与大规模平行签名测序（MPSS）在 1995—2000 年间确立了“表达量 = 可数标签”的数字测量范式，是 4.7 节 RNA 测序的直系祖先（Velculescu et al., 1995；Brenner et al., 2000；Gibson & Muse, 2009）。
4.6.1 计数式定量的思想：数字印记
微阵列与 Northern 印迹一类杂交测量的输出是荧光或显色强度——连续的模拟量(analog signal)。强度受标记掺入率、杂交动力学、洗涤条件与扫描增益的多重影响，误差结构复杂，必须依赖 4.4 节那样的归一化事后校准；探针的结合容量有限，强信号趋于饱和、弱信号没入背景，动态范围通常只有三四个数量级；而探针序列必须预先设计，凡未列入阵列的转录本一概不可见。
计数式测量提供另一条路：若能从每个转录本分子上截取一段足够特异的短序列作为标签(tag)，则样品中该标签出现的次数就是该转录本分子数的直接估计——丰度之比等于计数之比。这种测量是“数字的”：观测值为整数，抽样噪声为泊松型，标准差约为 √N，可以在测序之前预算；动态范围只受标签总数限制；标签来自实测序列，不依赖任何先验知识，未知转录本与已知转录本机会均等地被计数。这就是所谓的数字基因表达谱(digital gene expression profile)：以“数字印记”代替“模拟强度”来登记每个基因的存在与多寡。
杂交式测量（模拟量）
输出连续强度；误差来源复杂，需事后归一化；信号饱和限制动态范围；依赖预先设计的探针；跨实验室结果难以直接合并。
计数式测量（数字量）
输出整数计数；泊松噪声可先验预算；动态范围随标签总数扩展；无需先验序列，可发现新转录本；计数天然可跨平台累加比较。
这一思想在大规模 EST 计划中已有雏形：随机测序 cDNA 克隆，以克隆出现的频率粗估表达丰度。SAGE 与 MPSS 的贡献在于把“随机抽样、顺手计数”改造成系统化、可统计检验的全转录组测量方案。
数字印记：为 RNA 测序奠基的概念框架。可以把杂交比作“称重”、计数比作“逐枚点数”：称重快但受秤的精度与量程限制，不同秤的结果难以直接累加；点数慢一些，误差却只由点到的枚数决定，且任何人点同一堆硬币的结果可以合并。SAGE 与 MPSS 确立的“整数计数矩阵 + 泊松统计”框架被 RNA 测序全盘继承：RNA 测序改变的不是范式，而是获取标签的通量与成本——标签从酶切的十几个碱基变成随机片段，串联体克隆换成平行测序仪（见 4.7 节）。
4.6.2 SAGE 的原理：两酶分工与串联测序
基因表达序列分析(serial analysis of gene expression, SAGE)由 Velculescu 等于 1995 年提出，以“两酶分工”实现计数思想：锚定酶(anchoring enzyme)统一标签的取样位置，标签酶(tagging enzyme)统一标签的长度。建库流程如下：
- 以生物素标记的 oligo(dT) 引物反转录 mRNA 为双链 cDNA，3′ 端因此携带生物素；
- 用锚定酶 NlaIII（识别序列 CATG，平均每 256 bp 出现一次）酶切，链霉亲和素磁珠只捕获最靠 3′ 端的片段——由此保证每个转录本只在一个确定位置取样；
- 将含 BsmFI 识别位点的接头连接到 CATG 四碱基突出端；
- 用标签酶 BsmFI（IIS 型限制酶，切点位于识别位点之外 14–15 bp）自接头一侧切出约 14 bp 的短标签，其中 5′ 端 4 bp 恰为 CATG，其余约 10 bp 是该转录本的特异序列；
- BsmFI 留下平末端，两个标签随机头尾连接成约 28 bp 的双标签(ditag)，经 PCR 扩增后再彼此串联成含数十个标签的串联体(concatemer)；
- 串联体克隆后以 Sanger 法测序，按 CATG“标点”切分读长、逐条计数，再将标签回贴参考序列，得到“基因 × 计数”的数字表达谱。
锚定酶与标签酶的分工细节。锚定酶必须是识别 4 碱基的常见酶：位点平均每 4⁴ = 256 bp 出现一次，几乎所有转录本都至少含一个，且 NlaIII 切出四碱基 3′ 突出端，便于接头定向连接。标签酶必须选 IIS 型限制酶：其切点位于识别位点之外定长处，标签长度由酶决定而与序列无关。标签长度是“唯一性 ↔ 测序成本”的折中——标签越长越可能唯一对应基因，但串联体中每个标签占用读长越多、成本越高。
串联体的经济性正在于此：一条 600–800 bp 的 Sanger 读长可携带 20–30 个标签，相当于把昂贵的凝胶读长“批发”给几十个转录本；首篇论文即以人胰腺组织演示了这一数字表达谱（Velculescu et al., 1995）。计数精度由泊松统计决定：要在计数层面分辨 1.5 倍的丰度差异，单一标签需积累数百条计数——深度与成本的矛盾自此贯穿标签技术始终。
习题 4.6-2
锚定酶为什么选择识别 4 碱基的 NlaIII（CATG），而不是识别 6 或 8 碱基的限制酶？这一选择仍会遗漏哪类转录本？
参考解答4 碱基位点平均每 4⁴ = 256 bp 出现一次，几乎所有成熟的长度可观的转录本在其 3′ 区域内至少含一个 CATG，保证“一个转录本、一个标签位”；若改用 6 或 8 碱基酶，位点平均每 4 kb 或 65 kb 才一个，大量转录本完全没有位点，将被整类遗漏。此外 NlaIII 留出四碱基突出端，使含 BsmFI 位点的接头可以高效率定向连接。代价是双向的：3′ 最末端约 256 bp 内不含 CATG 的（尤其是较短的）转录本成为盲区，而短转录本恰好更容易整体落入盲区；同时“一位点一标签”的设计天然放弃了对中段序列的全部信息。
4.6.3 标签映射与计数统计
计数之后必须回答“标签属于谁”。早期参照库是 EST 与 cDNA 序列。14 bp 标签的可能组合虽有 4¹⁴ ≈ 2.7×10⁸ 之多，但参照序列同样庞大：基因家族的同源区、重复元件丰富的 3′ UTR 都会使不同基因共享同一标签；完全不含 CATG 的转录本则根本没有机会进入文库；标签既可能来自正义也可能来自反义转录本，回贴若不区分链方向便会张冠李戴。映射歧义因此成为 SAGE 数据分析的第一难题。
标签映射的三个“黑洞”。其一，共享标签：多个基因产生同一标签，计数无法归属，只能整条弃用或合并报告；其二，无位点遗漏：不含锚定酶位点的转录本丰度被系统性记为零，这是结构性偏差而非随机噪声；其三，链方向混淆：不区分正义/反义来源的标签会把两条转录本的计数叠加。实践对策：只保留唯一匹配标签、以“未映射标签比例”作为文库与参照库质量的质控指标，并用更长的标签从源头压低歧义（见下文 LongSAGE）。
两个样本间同一标签计数的比较，统计学基础是泊松抽样：计数的方差近似等于其均值。据此可构造最直观的比较统计量：
Audic 与 Claverie（1997）为数字表达谱给出了系统的比较框架，SAGE 时代的卡方与精确检验即源于此。同时必须记住：一张表达谱要同时检验上万个标签，4.4 节的多重检验与假发现率思想在这里同样不可或缺。公式 (4.6-1) 也直观给出精度直觉——计数为 100 的标签，噪声约 10，即 10% 的相对不确定度；低丰度转录本的可靠测量需要更深 的文库。
针对映射歧义，Saha 等（2002）提出LongSAGE：将标签酶换为 MmeI（切点在识别位点外 18–20 bp），标签延长至约 21 bp。可能组合增至 4²¹ ≈ 4.4×10¹²，标签足以唯一定位到基因组，除定量外还可直接用于基因组注释——发现此前未注释的外显子与新转录本，完成了“用转录组注释基因组”的一次示范。
习题 4.6-1
两个等库容（各 50 000 条标签）的 SAGE 文库中，基因 G 的标签计数分别为 150 与 190。（1）用式 (4.6-1) 判断丰度差异在名义上是否显著；（2）若另一基因的计数为 12 与 25，该式是否仍适用？（3）为什么还要做多重检验校正？
参考解答（1）z = (190 − 150)/√(150 + 190) = 40/√340 ≈ 2.17，双侧 p ≈ 0.03，名义上显著。（2）不理想：小计数场合正态近似变差，且 12 与 25 的期望计数均低于常用经验阈值，应改用精确检验，或将多个相关标签合并后再检验。（3）一次转录组比较同时检验约上万个标签，p ≈ 0.03 的结果在万次检验中极可能纯属噪声；须按 4.4 节的假发现率框架控制整张“显著清单”的污染比例。此题同时说明计数测量的精度受 √N 噪声约束：要把相对误差压到 5%，单标签需积累约 400 条计数。
习题 4.6-3
设人类转录组约有 4×10⁴ 个标签取样位置。用“生日碰撞”近似估计 14 bp 标签中有多少对位置共用同一序列；若换成 21 bp 的 LongSAGE 标签又如何？
参考解答随机等概率标签的碰撞对数期望约为 n²/(2·4ᴸ)。L = 14 时：n² = 1.6×10⁹，除以 2×2.7×10⁸ ≈ 5.4×10⁸，得约 3 对——即令只有 4 万个位置，仍应期望若干歧义标签；真实转录本远多于基因数（剪接变体、非编码 RNA），歧义更多。L = 21 时：1.6×10⁹ / (2×4.4×10¹²) ≈ 2×10⁻⁴，碰撞几乎不可能发生。这正是 LongSAGE 延长标签的动机之一（Saha et al., 2002）。
4.6.4 MPSS：大规模平行签名测序
大规模平行签名测序(massively parallel signature sequencing, MPSS)由 Brenner 等于 2000 年提出，思路是把“克隆”与“读取”都工业化。cDNA 文库被克隆到微珠上：经接头匹配，每个微珠表面固定同一 cDNA 的数万份拷贝；微珠平铺于流动室中形成二维阵列，光学系统对整场成像。读取不依赖 Sanger 凝胶，而依赖循环解码：每一轮以一组可区分的“解码探针”与紧贴切口的 4 个碱基组合杂交，成像即读出这 4 个碱基——这是“每轮 4 碱基”的编码读取策略，用少量探针组合分辨 256 种四联体；随后以 IIS 型酶精确切去已读片段、露出下一 4 nt，进入下一轮。循环 4–5 轮后，每个微珠累积出 17–20 bp 的签名，签名同样锚定在最 3′ 的 DpnII（GATC）位点。
与 SAGE 相比，MPSS 省去了凝胶纯化、串联体连接、克隆与挑斑等繁复的湿操作，一次运行可读取数十万条标签（改进平台达百万量级），通量高出一至两个数量级；其标签更长，映射歧义也相对缓和。但整套系统是封闭的商品平台：仪器、试剂、解码算法与数据格式均不公开透明，成本高昂且难以学术自制。二者互补地证明了“计数定量”可以规模化，也都在第二代测序成熟后（约 2005—2008 年）相继退场。
| 特征 | SAGE（1995） | MPSS（2000） |
|---|---|---|
| 标签锚定位点 | 最 3′ 的 NlaIII 位点（CATG） | 最 3′ 的 DpnII 位点（GATC） |
| 标签长度 | 约 14 bp（LongSAGE 约 21 bp） | 17–20 bp |
| 读取方式 | 双标签串联体克隆 + Sanger 测序 | 微珠克隆 + 循环解码（每轮 4 碱基） |
| 通量（每次运行） | 数千至数万标签 | 数十万（改进平台百万量级） |
| 系统形态 | 开放：常规酶与通用测序仪 | 封闭：商品化仪器与专用试剂 |
| 主要瓶颈 | 建库繁琐，需大量克隆测序 | 仪器封闭，成本高、透明度低 |
4.6.5 应用与局限：从肿瘤普查到让位 RNA 测序
标签技术最成功的应用是肿瘤转录组普查。Velculescu 等（1999）汇总多种正常与肿瘤组织的 SAGE 文库，合计数百万条标签，建立起跨组织、跨病理状态可直接比较的数字转录组图谱，并成为美国癌症基因组解剖计划（CGAP）数据基础设施的组成部分。因为计数是绝对量，不同实验室、不同时期积累的标签文库可以合并再分析——这是相对定量的微阵列难以企及的优势。无先验假设的“普查”还持续产出新发现：新的转录本、肿瘤中特异表达的 3′ 端序列、以及此前未被注释的外显子（Saha et al., 2002）。
局限同样清晰。其一，标签短，映射歧义使部分计数无法归属（4.6.3）；其二，“一转录本一位点”的强 3′ 偏置放弃了对剪接变异、体细胞突变与 RNA 编辑的全部信息——同一基因的不同 isoform 共享同一标签，被合并计数；其三，足够的统计深度依赖海量克隆测序，深库成本高昂，泊松噪声在低丰度端依旧苛刻；其四，双标签连接与 PCR 扩增步骤引入组成偏倚。值得注意的是：这些弱点几乎没有一个是“计数”本身的弱点，它们大多源于“标签太短、取得太费”——这正是后来者得以精准替代的入口。
从 SAGE 到 RNA 测序：计数思想的胜利与标签技术的退场。RNA 测序对 SAGE 只做了两处替换：把酶切标签换成随机片段——每条读段本身就是“标签”；把串联体克隆换成平行测序仪——无需连接、克隆与凝胶。而计数框架被完整继承：整数计数矩阵、按文库规模归一（4.7 节的 RPKM/TPM）、泊松及负二项差异检验，正是 Audic–Claverie 一脉统计思想的放大。约 2008 年前后，高通量测序成本跌破临界点，RNA 测序在通量、标签长度与信息完整性上全面占优，SAGE 与 MPSS 随之退场；原书第 3 版出版于 2009 年，恰是这一交接的见证时刻（Gibson & Muse, 2009）。
关键术语
- 标签序列技术 (tag-sequence approach)
- 以短序列标签代表转录本、以标签计数代表丰度的表达测量思想统称。
- 基因表达序列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE)
- 1995 年提出的标签串联—测序计数方法，每个转录本取最 3′ 锚定位点处约 14 bp 标签。
- 锚定酶 (anchoring enzyme)
- 在恒定识别位点切割以统一标签取样位置的酶；SAGE 用 NlaIII（CATG），MPSS 用 DpnII（GATC）。
- 标签酶 (tagging enzyme)
- IIS 型限制酶，切点位于识别位点之外定长处，决定标签长度；SAGE 用 BsmFI，LongSAGE 用 MmeI。
- 双标签 (ditag)
- 两个标签经平末端头尾连接而成的约 28 bp 单元，是串联体的构建模块。
- 串联体 (concatemer)
- 多个双标签首尾相连的长 DNA 分子，使一次 Sanger 读长携带数十个标签。
- 数字基因表达谱 (digital gene expression profile)
- 以整数计数表示的转录本丰度谱，噪声为泊松型且可先验估计。
- 大规模平行签名测序 (massively parallel signature sequencing, MPSS)
- 微珠克隆配循环解码、一次运行并行读取数十万条 17–20 bp 签名的封闭平台技术。
参考文献与延伸阅读
- Gibson G, Muse SV. 2009. A Primer of Genome Science, 3rd ed. Sunderland (MA): Sinauer Associates. (Chapter 4)
- Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW. 1995. Serial analysis of gene expression. Science 270: 484–487.
- Velculescu VE, Zhang L, Zhou W, et al. 1997. Characterization of the yeast transcriptome by serial analysis of gene expression. Cell 88: 243–251.
- Velculescu VE, Madden SL, Zhang L, et al. 1999. Analysis of human transcriptomes. Nature Genetics 23: 387–388.
- Brenner S, Johnson M, Bridgham J, et al. 2000. Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays. Nature Biotechnology 18: 630–634.
- Saha S, Sparks AB, Rago C, et al. 2002. Using the transcriptome to annotate the genome. Nature Biotechnology 20: 508–512.
- Audic S, Claverie JM. 1997. The significance of digital gene expression profiles. Genome Research 7: 986–995.