3.4 蛋白与转录的联合建模

3.4.1 配对与非配对：数据结构先行

前两节分别拆解了质谱流式与 CITE-seq（3.1、3.2），3.3 节讨论了路线之间的取舍。本节处理两条数据流汇合之后的事：当 RNA 与蛋白摆在同一张桌上，怎样建模才算用足了它们。第一块基石不在算法，而在数据结构——配对与否。

CITE-seq 的两条测量嵌在同一细胞内：寡核苷酸偶联抗体给出抗体衍生标签(antibody-derived tag, ADT)计数，同一次测序又读出该细胞的转录组（Stoeckius et al., 2017）。于是每个细胞对应两行数字——一条基因表达谱、一条蛋白丰度谱。写成矩阵，即细胞×基因矩阵 X 与细胞×蛋白矩阵 Y，二者共享行索引：第 i 行都是细胞 i。列数悬殊：基因列通常上万，蛋白列受面板限制，约 100–300（图 3.4-1 左）。

质谱路线则几乎必然非配对。SCoPE2 一类的设计里，一份样本的部分细胞走单细胞 RNA 测序，其余细胞走单细胞质谱，两套细胞不相交，对应关系只到亚群层面（Specht et al., 2021）。原因在化学：质谱制备破坏细胞——裂解、酶解之后蛋白已化为肽段池，同一细胞不可能再提取 RNA；CITE-seq 的抗体染色与转录组读出反而能在一次捕获中并行完成。

配对与否划定可用的方法集合：配对数据允许逐细胞的联合——加权最近邻、因子分解、同一细胞内的 mRNA–蛋白相关；非配对数据只能群级对齐——亚群匹配与伪体相关。建模之前先核对数据结构，这是第一条纪律。

3.4.2 为什么要联合：两个模态的互补

联合的价值来自互补，而互补至少有三个层面。第一个层面是测量特性。转录组广而噪：覆盖上万基因，但单细胞计数稀疏，低表达基因大量缺失，近邻结构混有技术噪声。蛋白窄而稳：亲和面板只问几十到几百个预设问题，信号经靶向富集，计数深度高、动态范围被压缩；质谱路线则无偏好地覆盖表达蛋白，SCoPE2 单个细胞可定量约千种蛋白（Specht et al., 2021），深度仍远逊转录组。一宽一窄、一噪一稳，两套度量各执一端。

第二个层面是时间尺度。mRNA 是即时调控的读出，蛋白是合成与降解累积之后的存量。1.1 节的转录-翻译鸿沟，在配对数据里第一次成为可计算对象：同一基因的转录本与其蛋白，可以在同一群细胞内算出一个相关系数——鸿沟从比喻变成了一个数。

第三个层面在注释。RNA 聚类给出的亚群，身份需要标志坐实；谱系标志（如 CD 抗原）在蛋白层的分辨率常高于其转录本——转录本低表达或缺失时，ADT 信号依旧清晰。联合建模把"RNA 定结构、蛋白定身份"的分工收进同一次分析。

3.4.3 朴素方案：直接拼接的失败模式

最朴素的联合是拼接：两条矩阵各自归一化，按列串成一个大矩阵，照旧跑 PCA 与聚类。这在算术上可行，在统计上有两个失败模式。

其一是维度失衡。基因列与蛋白列相差约两个数量级，方差导向的降维把主方向让给 RNA 子空间——列多不等于信息多，纯粹的维数堆积足以淹没蛋白列里更干净的信号。其二是噪声模态主导。单细胞 RNA 的稀疏计数让距离以噪声方差为主要成分，拼接把两个模态测量特性的差异原封不动搬进联合空间，聚类于是被 RNA 噪声牵着走，蛋白层清晰的谱系结构反而失语。

两个失败模式指向同一个结论：问题不在"要不要加权"，而在"在哪一层加权"。给列乘先验权重既难确定、也治不了噪声结构的问题。由此分出两条成熟思路：一条不动特征空间，在图层按细胞加权——加权最近邻；一条先把各模态压进低维因子空间再对齐——因子分解。

3.4.4 思路一：加权最近邻

加权最近邻(weighted nearest neighbors, WNN)的出发点：不拼特征，拼图。第一步，各模态分别降维、建 k 近邻图，得到 RNA 图与蛋白图；第二步，为每个细胞学一组模态权重；第三步，按权重合成一张加权图，聚类与可视化都在加权图上进行（Hao et al., 2021）。

全部巧思在第二步：权重从哪里来。判据是跨模态的可预测性——若 RNA 上的近邻在蛋白空间同样接近，两个模态在细胞 i 附近相互印证，RNA 在此处信息丰富；反之，若 RNA 近邻在蛋白空间散得很开，说明 RNA 在此处更多是噪声。把这句话写成公式即式 (3.4-1)：逐模态的加权误差经 softmax 化为权重。

合成是逐细胞的加权平均：

机制直觉：两个模态的信息量随细胞状态移动。增殖中的细胞转录程序活跃，mRNA 与蛋白之间时滞大，结构主要写在 RNA 上；终末分化的细胞 mRNA 丰度低而稳定，表型差异由存量蛋白承载。固定权重（例如恒等的 1:1）对两种状态都不合适；WNN 把权重做成细胞 i 的函数，让"话语权"随局部信息量移动（图 3.4-2）。

3.4.5 思路二：因子分解

第二条思路假设两个矩阵背后存在共同的低维结构。因子分解(factor analysis)把每个模态写成因子得分与载荷之积加噪声，因子按载荷分布分为两类：在多个模态都有载荷的共享因子捕获 mRNA 与蛋白的共变，只在一个模态有载荷的模态特异因子保留该模态独有的变异。多组学因子分析（MOFA）即按此框架实现，其后续版本把设定扩展到多组与单细胞（Argelaguet et al., 2018）。

因子分解的长处是无监督且可解释：因子载荷直接回答"哪个蛋白与哪组基因共变"，不需要预先指定标志基因。代价有二。其一，对配对性要求严格——因子要在同一细胞上对齐两个模态，非配对数据只能退到群级聚合或多组设定。其二，因子数的选择敏感：因子太少，共享结构与模态特异结构混叠在一起；太多，每个因子只解释零星方差，解释力被稀释。

两条思路是分工而非竞争。WNN 在图层合成、保留各模态自己的度量，适合以聚类与可视化为目的的探索；MOFA 在因子层合成、给出显式的共变结构，适合回答"蛋白与转录在哪些方向上联动"，实践中两者常并行互证。

3.4.6 下游应用：聚类、标签转移与伪体相关

联合聚类与可视化最直接：加权图或共享因子照常接入 Leiden 一类社区检测与 UMAP 嵌入，流程与单模态无异，改变的只是"距离"的来源。

跨模态的标签转移(label transfer)：用带蛋白注释的参考数据（如 CITE-seq）给只有 RNA 的查询数据命名——在共享空间对齐后，参考群标签按邻近关系转给查询细胞（Hao et al., 2021；Argelaguet et al., 2021）。方向也可以倒转：纯蛋白的质谱流式数据可借用转录组参考的注释体系。标签转移把"逐群手工比对标志基因"变成可复现的一次计算。

差异检验有多模态版本：同一批细胞在 RNA 层做差异表达、在蛋白层做差异丰度，两份清单并排审读。两层不一致本身就是线索——转录变了而蛋白没变，指向翻译或降解层面的缓冲。多模态差异分析因此不只是两次单模态检验的拼接，而是把两层证据放在同一批细胞上对账。

质谱路线的非配对联合只有一条可行路径：按群聚合。两侧各自聚类后以共有标志对齐亚群，亚群内聚合为伪体，再在群级做蛋白–RNA 相关（Specht et al., 2021）。伪体相关回答"哪些分子的丰度梯度在群间一致"，不回答"同一细胞内 mRNA 多、蛋白就多"——后者需要配对数据。聚合还引入系统性偏差：群的选择改变相关系数（取 5 个群与取 50 个群结果不同），群间差异也可能伪装成分子间的协同。

3.4.7 陷阱与克制：相关、衰减与无中生有

第一重克制：相关不等于调控。mRNA 与蛋白同涨，可能是转录到翻译的因果链，可能是共同的上游状态，也可能只是群结构——两个分子都随细胞类型分化而变。配对数据让相关可以计算，没有让方向可以推断；方向的证据来自扰动实验与时间序列，不来自相关系数本身。

第二重克制：测量噪声衰减相关。两个模态各有噪声时，观测相关被系统性压低：

第三重克制：整合不创造信号。WNN 的权重再自适应、MOFA 的因子再优雅，也不能无中生有——面板只有一百来种标志，就不会有第一百零一种蛋白的信息；RNA 深度不足时，权重学习本身就在噪声上进行。整合方法的诚实用法，是把两个模态各自已有的信号按合适比例组合，而不是指望相乘生出新生物学。

本节把多模态配对数据的整合建模归纳为四条：

• 数据结构先行：配对与否（行索引是否共享）决定可用方法的集合，质谱路线天然非配对；
• 朴素拼接败于维度失衡与噪声主导，解法是把加权移到图层（WNN，逐细胞自适应权重）或因子层（MOFA，共享因子与模态特异因子）；
• 下游三用：联合聚类与可视化、跨模态标签转移、双模态差异审读；非配对数据退到伪体相关，并接受聚合偏差；
• 三条边界同样重要：相关不等于调控、噪声按式 (3.4-3) 衰减相关、整合不创造不存在的信号。

整合给出综合视图之后，单细胞数据共同的下游统计问题——缺失值的处理、差异检验与多重假设控制——在第 4 章展开。