4.2 scp 包与 QFeatures：可复现流程的骨架

4.2.1 一串中间层：电子表格式的分析为何失败

4.1 节给出了定量矩阵的解剖——行是分子、列是细胞通道、层级自 PSM 而上。本节转向另一个问题：这串层级在分析过程中由谁管理。一次完整的处理远不止三张表：PSM 层先做质量过滤，聚合(aggregation)为肽段层；肽段层再做过滤、归一化与缺失值填补(imputation)，聚合为蛋白层；蛋白层最后做批次校正(batch correction)与统计。PSM 层还要先按 run 拆分、再合并。一个"最终矩阵"的背后，是十几次中间变换——每一次都动了行、列或数值。

常见的做法是让每层单独成表：过滤脚本输出 pep.csv，电子表格里手工核对、删几行，另存为 pep_改.csv，再交给聚合脚本。这条路走得通，却有三个结构性的失败模式。其一，中间层丢失：每一步覆盖上一步的产物，分析结束时只剩最终矩阵；想核对某个蛋白在肽段层的证据，旧文件已经不在了。其二，参数不可追溯：阈值写在脚本注释里、表格的筛选条件里，甚至只存在于操作者当天的记忆里；论文所写的"1% FDR"究竟是哪一步、作用在哪一层，无从对证。其三，不可复现(reproducibility)——同一批数据与同一段代码，换个人、换台机器理应得到同一结果，如今却做不到；审稿人要求补一张图，只能从头再做一遍，而"再做一遍"又会产生一套新的中间文件。

单细胞数据把这套隐患进一步放大。一次分析动辄数十个 run、成百上千个细胞通道，缺失值占比高，批次结构与多重标记交织在一起；表格行数以万计，"手工核对"从两小时变成两周，出错的机会随之上升。规模本身就否定了文件接力的做法——不是做得更仔细一些就能救回来。

这三个失败模式与细心与否无关。把有亲缘关系的数据拆散在一堆文件与脚本变量里，数据之间的关系本身就没有任何载体；关系没有载体，丢失与错位只是时间问题。要消除它们，靠的不是更强的自律，而是换一种组织方式——这正是 QFeatures 与 scp 包要解决的问题。

4.2.2 QFeatures 的数据模型：一个容器装下全部层

QFeatures 是 Bioconductor 上为"多层定量"设计的容器，出自 UCLouvain 的 Gatto 与 Vanderaa 之手，也是 scp 包的基础设施。核心想法一句话：与其让每一层单独成表，不如让全部层住进同一个对象。对象里装三类成分。

第一类是层(assay)：每层是一张定量矩阵，行是分子、列是细胞通道。PSM 可按 run 各占一层，肽段与蛋白各一层。关键在于：派生新层时旧层不删除——过滤前的 PSM 层与过滤后的并存，聚合前的肽段层与聚合后的并存。对象越处理越"厚"，任何一步都拿得出来。

第二类是行注释(rowData)：每层自带一张行注释表，描述该层的每一行——PSM 层放谱图得分、电荷、样品/载体信号比；肽段层放序列与蛋白归属；蛋白层放特有肽段数。注释随层演化：聚合造出新行，就要配出配套的新注释行。第三类是列注释(colData)：全对象共享一张列注释表，每个细胞通道一行——所属 run、通道号、SampleType（载体、空白还是单细胞）、细胞类型、批次。列是所有层公共的坐标，注释自然也只有一份。

把层与层连接起来的，是层间血缘(assay links)。从某层派生新层时，容器记下"新层第 i 行由父层哪些行而来"。于是任何一个蛋白都可以顺藤摸瓜：蛋白层的这一行，来自肽段层的那三行，再往上追溯到 PSM 层的十来行及其谱图得分。定量数字不再悬空，而是带着完整的来历。4.4 讨论缺失值、4.6 讨论批次效应时，反复用到的正是这种回溯能力——"这个值是怎么来的"可以一路查到证据层。

这套"容器＋血缘"的设计是全书数据处理的心智模型。此后每一节介绍的处理步骤，都可以用同一组问题去读：作用在哪一层？删了行、换了值，还是造了新层？行注释与列注释如何随之更新？血缘是否保持完整？4.3 的标准化流程将逐条回答这些问题；本节先把骨架立起来。

列注释只此一份，还有一层用意：按细胞做任何筛选——剔除中位数 CV 过高的细胞、删除空白通道——都在对象层面一次完成、全层同步。列是所有层的公共坐标，动列必须全层一起动；这正对应习题 4.2-2 中"按细胞过滤"那一步的机理。

4.2.3 scp：把处理写成函数链

QFeatures 管数据，scp 包管步骤。scp 由 UCLouvain 团队开发，在 QFeatures 之上补齐单细胞专用环节，并把整套处理组织成标准化流程（Grégoire et al., 2024）。入口是一个函数：readSCP 读入两张表——定量表（如 MaxQuant 输出的 evidences.txt）与通道注释表——按 run 拆层，一步得到装好注释的对象。Galaxy 教程所用的 SCoPE2 子集即由 1,362 行 × 150 列的定量表与 65 行 × 7 列的注释表起步，readSCP 之后直接进入处理链（Gomoryova and Hecht, 2025）。

处理函数遵守同一约定：接受对象、返回对象。过滤按行注释删行；聚合把一层归并为新层；归一化与填补在层内换值；批次校正整层重写。无论哪种操作，进出都是同一个容器，行注释、列注释与血缘自动随行。于是整条处理可以写成一条函数式流水线(functional pipeline)：

scp1 <- readSCP(assayData = evidences,      # 定量表（PSM × 通道）
               colData = sampleAnnotation, # 通道注释（细胞、批次）
               runCol = "Raw.file")        # 按 run 拆分建层
scp1 <- filterFeatures(scp1, ~ Reverse != "+")     # PSM 层：删行
scp1 <- aggregateFeatures(scp1, i = 1:4, fcol = "peptide",
                          name = "peptides",       # PSM → 肽段（新层）
                          fun = matrixStats::colMedians)
scp1 <- logTransform(scp1, i = "peptides", base = 2)  # 派生 log2 层

上例中，readSCP 按 run 建层；filterFeatures 在 PSM 层按行注释设门槛（此处以剔除反向序列命中为例）；aggregateFeatures 把各 run 的 PSM 按肽段归并，生成名为 peptides 的新层，四个旧层原样保留；logTransform 再派生出对数层，与父层一一对应。代码为示意，各步参数、过滤指标与完整流程见 4.3。

链条上每挂一个函数，都应顺手核对两件事：对象的层数与各层形状是否符合预期，行注释与列注释是否随操作同步。把这两项检查写进脚本，异常会在当场暴露，而不是在结论里潜伏。

4.2.4 复现的载体：SCP.replication 与 scplainer

软件骨架的价值要用硬标准检验：能否用同一套代码，把一篇已发表论文的全部结论原样重演。SCP.replication 项目（UCLouvain 团队）为此而设：以 scp 重写已发表的单细胞蛋白组学分析并公开全部代码，SCoPE2（Specht et al., 2021）即其中之一。重演暴露出两个高频难点——批次校正与缺失值处理：原论文对这两步的描述往往不足以恢复数字，重演者只能做有依据的选择，并把每处选择写明（Vanderaa and Gatto, 2021）。

"论文结论附代码与数据"由此改变领域风气（呼应 2.3）：结果不再是黑箱数字，后人可以在同一数据上换参数、换方法重新计算，方法之间的比较第一次有了共同地基——比较发生在同一数据、同一副骨架上，而非各说各话。下游建模也被纳入同一套对象：scplainer 以线性模型对处理完成的蛋白层做差异丰度(differential abundance)分析，细胞类型、批次与载体效应作为协变量放进同一个模型（Vanderaa and Gatto, 2025）。本节点到为止，建模细节见其原文。

代码之外还要有数据。配套的 scpdata 包把 SCoPE2 等已发表数据集整理成统一格式，可直接读入对象，"论文、代码、数据"三件套在同一个入口汇合（Vanderaa and Gatto，scp 包文档）。重演的门槛由此从"向作者逐一索要文件"降为"下载并运行"。

4.2.5 三个入口，一副骨架

同一副骨架有三个常见入口。其一是 R/Bioconductor：代码入口，控制最完全，门槛也最高，需要 R 基础与对每步机理的理解。其二是 Galaxy：图形界面入口，把同一套 scp 流程封装成网页工具，每步是一个表单，无需编程即可走完标准化流程；参数与数据自动存入"历史"，复现要求同样满足（Gomoryova and Hecht, 2025）。其三是 DIA 侧的专用软件：DIA-NN 等把检索与定量一体完成，输出可直接进入下游统计，plexDIA 流程即由其承担（Derks et al., 2023）。

工具不同，骨架相同。Galaxy 的"工具"对应函数，"历史"对应代码档案；DIA-NN 的输出报告对应行注释；层与血缘的读法在三个入口下都能对上。读一个新工具时先问它作用在哪一层、动了行列还是换了数值，比记住按钮的位置有用得多。信息学流程组合的比较也依此组织——基准评测评的是流程，不是单个软件（Wang et al., 2025）。

入口的选择因此是务实问题而非立场问题：常规分析走 Galaxy，最快得到可复现的结果；方法学比较回到 R，链条的每个环节都可改写；DIA 数据先经专用软件完成检索与定量，再接续同一套下游骨架。三个入口产出的矩阵，读法完全一致。

4.2.6 何时偏离标准流程

什么时候该自己写代码？默认答案：不该。标准流程经过多数据集的复用与检验，参数有出处、行为有文档（Grégoire et al., 2024）；自己写下的每一步，都是一处需要自行验证、自行报告、自行维护的孤岛。偏离的正当理由大致三类：数据形态是标准流程不支持的（新型标记或采集方式）；工作本身就是方法学研究（比较与基准评测）；文献已明确某一步在此情形不适用。如果只是想换个阈值——那不是写代码的理由，是改参数。

这也是社区白皮书的立场：完整报告每一步的方法与参数，性能声明要有基准支撑（Gatto et al., 2023）。复现由结构保证——参数留在代码里、层留在容器里、血缘留在对象里；写作时如实交代偏离及其理由，读者才能判断结论的稳健程度。判断力不在于会写多少代码，而在于能说清每一步为什么这样走。

反过来，标准流程也不是护身符。参数照抄而不问数据是否满足其假设——填补之前缺失是否过于集中、批次结构是否可辨识——同样会得到"可复现的错误结果"。骨架保证的是过程可查，不是结论必然成立；结论仍要靠 4.3 至 4.6 的机理判断逐节支撑。

本节立起了贯穿第 4 章的软件骨架：

• 一次分析 = 一个容器 + 一串函数：层（assay）、行注释（rowData）、列注释（colData）、层间血缘（assay links）四件套装进同一个对象；
• 复现由结构保证：参数在代码里、层在容器里、血缘在对象里，重跑即重现，回溯有据可查；
• 入口不同、骨架相同：R/Bioconductor、Galaxy、DIA 专用软件可按同一张地图阅读；
• 偏离标准流程的三类正当理由：数据形态不支持、方法学研究、文献依据。
• 默认走标准流程；偏离须说出理由，并把理由写进报告。

4.3 节将沿着这副骨架，走完从 PSM 过滤到批次校正的完整标准化流程。