3.5 节的关联分析把变异当作工具，本节把群体本身当作研究对象。前几节反复出现的量——等位基因频率、基因型频率、连锁不平衡——都只有在群体的语境中才有定义；而它们如何随世代变化，则由突变、自然选择、遗传漂变与迁移四种动力共同决定。群体遗传学为全章提供两部理论引擎：其一是静态的，描述随机交配下等位频率与基因型频率之间的确定关系（哈代–温伯格平衡），它是基因分型质控的日常工具；其二是动态的，解释变异的频率分布为何呈现今日的形态——非洲群体多样性最高、非非洲群体连锁不平衡更长、某些致病突变在特定隔离人群异常常见。本节依次讨论这两条线索，并在结尾回到群体标签的生物学与社会界限这一不可回避的问题（Gibson & Muse, 2009；Hartl & Clark, 2007）。
3.6.1 Hardy–Weinberg 平衡
考虑一个理想群体：规模极大（无抽样涨落）、随机交配(random mating)、没有自然选择、没有迁移、没有突变。设某二等位位点上有等位基因 A 与 a，其在配子中的频率分别为 p 与 q = 1 − p。减数分裂不改变等位频率，故配子池中 A : a = p : q；随机交配等价于配子的随机结合，两种配子独立相遇的概率按二项式展开，即得基因型频率。
这一看似平凡的展开有三个重要性质。其一，平衡一代即达：无论亲代基因型频率如何扭曲（例如由近交或混合造成），只要个体按等位频率 p、q 随机贡献配子，子代基因型频率立即恢复 p2 : 2pq : q2——基因型构成的"记忆"只经一代就被随机交配抹平，而等位频率本身保持不变。其二，若无扰动，此后各代频率逐代不变，故称哈代–温伯格平衡(Hardy–Weinberg equilibrium, HWE)。其三，关系是不对称的：由基因型频率总可以重构等位频率，p = f(AA) + f(Aa)/2；但由等位频率反推基因型频率必须借助 HWE 假设。质控检验正是利用这一不对称——用观察到的等位频率计算预期基因型计数，再与观察计数比对。
实际数据对 HWE 的偏离因此携带信息，成因可分生物学与技术两类。生物学上：选型婚配(assortative mating)或近交使杂合子不足；群体分层导致的瓦伦德效应(Wahlund effect)——几个各自处于平衡的亚群被当作一个群体分析时，整体表现为杂合子不足；针对该位点本身的选择（各基因型适合度不等）亦可造成偏离。技术上：无效等位基因(null allele)——引物结合位点上的突变使一个等位在某些杂合个体中不能被扩增，杂合子被误判为纯合子；更一般地，3.2 节讨论过的等位丢失、交叉杂交等系统性分型错误几乎都表现为杂合子不足。检验统计量用 χ2 拟合优度：
HWE 检验作为质控工具。在全基因组关联研究的质控流水线中，HWE 检验有三个行规。第一，只对对照样本检验：病例组在某位点的偏离可能真实反映该位点与疾病的关联（关联本身会使病例的基因型分布偏离平衡），一刀切剔除会误伤易感位点。第二，阈值远严于 0.05：全基因组检验数十万至数百万个位点，若用常规阈值将随机剔除大量好位点，故常用 1×10−6 量级。第三，解读偏离的方向：杂合子不足是绝大多数技术错误（无效等位、等位丢失）与瓦伦德效应、近交的共同指纹；杂合子过剩少见，可提示近期群体混合。处置顺序通常是：查看该位点的分型簇图、复查重复样本与杂合度，确认技术原因后剔除或重新设计；若数据整体性偏离 HWE，则应怀疑分层或样本混淆，回到抽样与统计框架（3.5 节）处理，而非逐位点删失。
习题 3.6-1
某关联研究的对照组 500 人在一个 SNP 上的基因型计数为 AA 330、Aa 140、aa 30。(1) 计算等位频率与 HWE 预期计数；(2) 用式 (3.6-2) 手算 χ2（α = 0.05、df = 1 的临界值为 3.84），给出结论；(3) 若显著偏离，说明应优先排查哪些原因、按什么顺序处置。
参考解答(1) p = (2×330 + 140)/(2×500) = 800/1000 = 0.8，q = 0.2；预期计数 E = 500×0.64 = 320（AA）、500×0.32 = 160（Aa）、500×0.04 = 20（aa）。(2) χ2 = (330−320)2/320 + (140−160)2/160 + (30−20)2/20 = 0.31 + 2.50 + 5.00 = 7.81 > 3.84，拒绝 HWE（若用耶茨校正得 0.28 + 2.38 + 4.51 ≈ 7.17，结论不变）。(3) 偏离方向是杂合子不足：先查技术原因——该位点的分型簇图是否漂移、有无等位丢失或无效等位、重复样本是否一致；再查生物学原因——对照组是否混入了分层亚群（瓦伦德效应）或存在近交。确认技术原因后剔除或重新设计该位点；若是整体性偏离，则须回到抽样与分层校正层面处理，而不只是删位点。
3.6.2 等位频率动力学
平衡描述的是"没有动力时"的静止状态；现实中四种动力随时在推动等位频率变化。表 3.6-1 给出四力框架的比较：突变以每个位点每代约 10−8（核苷酸替换）的速率提供新变异，方向随机而速率极慢；自然选择按选择系数 s 定向改变频率，其"检测能力"取决于 s 与漂变噪声的对比——当 s 远小于 1/(2Ne) 时，选择来不及起作用，等位的命运由漂变决定；遗传漂变(genetic drift)是有限群体中抽样涨落引起的随机频率游走，最终使每个位点走向丢失或固定，且群体越小越快；基因流(gene flow)（迁移）则把不同群体的等位频率拉向一致。
| 动力 | 方向性 | 强度取决于 | 对群体内变异的作用 | 基因组数据中的典型信号 |
|---|---|---|---|---|
| 突变 | 随机引入新等位 | 突变率 μ（核苷酸约 10−8/位点/代） | 增加变异数目；速率极慢 | 新的私有变异、稀有变异 |
| 自然选择 | 定向（提高有利等位频率）或维持多态 | 选择系数 s 及其与环境的匹配 | 纯化选择削弱变异；正选择快速推高频率；平衡选择维持多态 | dN/dS 偏离 1、FST 异常、异常长的单倍型 |
| 遗传漂变 | 随机、无方向 | 群体大小（噪声尺度约 1/(2Ne)） | 随机丢失变异；小群体中丢失最快 | 杂合度随群体规模与瓶颈历史下降、奠基者信号 |
| 迁移（基因流） | 拉平群体间差异 | 迁移率 m 与群体间分化程度 | 群体内变异增加，群体间差异减少 | 渐变群、混血染色体片段 |
漂变的一个基础结论值得记住：频率为 q 的中性等位基因最终被固定的概率恰好等于 q 本身。由此出发，中性理论(neutral theory of molecular evolution)主张，分子层面上的大多数多态与大多数种内替换是中性或近中性的，其命运由漂变而非选择主导（Kimura, 1968）。该理论的一个直接推论即分子钟(molecular clock)思想：中性替换在群体中的固定速率等于其突变率，与群体大小无关，因而序列差异随时间大致匀速累积——这为用序列分歧估计群体分离时间提供了尺度，也是解读下文"走出非洲梯度"时的时间参照。中性理论并不否认选择，而是把"选择作用于哪些变异、以多大力度"变成可检验的统计问题：偏离中性预期的频率谱与分化模式，正是选择信号的来源（3.6.3 小节）。
有效群体大小（effective population size, Ne）：与真实群体具有相同遗传漂变速率（等价地，相同杂合度衰减速率）的理想随机交配群体的大小。Ne 几乎总是小于普查规模，原因包括：性别比失衡、个体繁殖成功率的方差远大于二项期望（少数个体留下绝大多数后代）、世代间数量波动——多代 Ne 由各代大小的调和平均而非算术平均给出，故最小的那一世代（瓶颈）具有决定性影响，瓶颈时 Ne 骤降。历史上人类常染色体位点的 Ne 估计在 104 量级，远小于数十万以上的历史普查规模。Ne 把一切与漂变有关的公式联系在一起：漂变噪声尺度 1/(2Ne)、多样性参数 θ = 4NeμL、每代杂合度衰减 1/(2Ne)。
有了 Ne，就可以把全基因组的变异打包成一个统计量来读群体历史。位点频率谱(site frequency spectrum, SFS)（亦称等位基因频率谱）把一个样本中所有分离位点按其次（或衍生）等位基因的拷贝数归类计数。中性、大小恒定的群体下，期望谱形与 1/i 成正比（i 为衍生拷贝数），故绝大多数分离位点处于低频。Watterson（1975）证明，分离位点总数 S 与群体多样性参数 θ = 4NeμL 成正比：θ 的 Watterson 估计量即 θW = S / an，其中 an = 1 + 1/2 + … + 1/(n−1) 为样本大小 n 决定的标准化常数。其思想可以一句话表述：给定突变率与序列长度，观察到的分离位点越多，推断的 Ne 越大。更重要的是谱形本身：群体扩张会在谱的左端（单例、双例）制造超额稀有变异；瓶颈则既损失稀有变异又使幸存变异富集于中间频率；负选择清除有害新突变，同样在左端留下缺口。图 3.6-2 以三种情景示意。频率谱因此被称为群体历史的"档案"——它把 3.6.4 小节的人口事件转写为可检验的统计形状。
习题 3.6-2
(1) 两个群体：甲连续四代普查规模均为 10 000；乙四代中三代为 10 000、一代因环境灾变仅余 100。以调和平均近似估计乙的 Ne，并与算术平均比较，解释差异的含义。(2) 某海洋鱼类普查规模数以亿计，为何遗传学估计的 Ne 常只有数万量级？
参考解答(1) 乙 Ne ≈ 4 / (3/10000 + 1/100) = 4 / 0.0103 ≈ 388，远小于算术平均约 7 525。漂变速率由"最小的一代"主导：瓶颈期丢失的变异无法在其后的扩张中恢复，故有效大小对瓶颈极其敏感——这解释了为何人类这样曾经历奠基事件的物种，其 Ne 远小于历史种群规模。(2) 普查规模大不等于每个个体对下一代的遗传贡献均等：极端的繁殖成功率方差（"抽奖式"繁殖，少数个体贡献绝大多数后代）、偏斜的有效性别比、世代间丰度剧烈波动，都会把 Ne 压到远低于普查值。Ne 度量的是漂变强度，不是个体计数。
3.6.3 选择信号的基因组证据
中性理论提供了"零假设"，选择检测就是在全基因组尺度上寻找对它的系统偏离。第一类证据来自群体间分化。固定指数(fixation index, FST)由杂合度的分解定义：
用法上有两个层面。基因组整体的平均 FST 反映群体历史——分化时间越长、漂变越强，背景分化越高；而分析者真正寻找的是相对于背景的离群位点：若某位点在两个群体中因当地环境而受到方向相反的选择（歧化选择），其等位频率差异将远超中性背景，FST 异常偏高。与肤色、膳食、病原体压力相关的多个位点在人群间的高分化即属此类信号（定性表述）。
第二类证据来自物种间序列分歧。比较编码区同义与非同义替换的速率，计算 dN/dS（非同义替换率与同义替换率之比）：比值明显小于 1 提示纯化选择（多数非同义突变有害、被清除），接近 1 提示中性演化（典型如假基因），大于 1 则提示非同义替换被正选择反复固定。基因组层面多数基因长期处于纯化选择之下。需注意该比值是漫长演化时间的平均，会把瞬时的正选择稀释在此前的纯化历史中，故对近期的、群体内的选择事件不够灵敏。第三类证据由此补足——单倍型方法：新的有利突变被选择快速推向高频率时，重组来不及打断其两侧序列，于是该等位携带者共享一段异常长而纯合的单倍型。延伸单倍型纯合度(extended haplotype homozygosity, EHH)度量随距离衰减的单倍型共享程度；iHS 统计量进一步比较携带衍生等位与祖先等位的单倍型的 EHH 衰减差异，对近期（数万年尺度内）、尚未固定的正选择最为灵敏——恰与作用在百万年尺度的 dN/dS 形成时间尺度上的互补（图 3.6-3）。
乳糖酶持久性的正选择。哺乳动物的默认程序是断奶后关闭乳糖酶基因（LCT）的表达；然而在历史上依赖乳业的种群中，成年持续表达乳糖酶的调控变异达到很高频率——这些变异不在 LCT 编码区，而位于其上游 MCM6 基因内含子中的增强子。关键事实有二。其一，独立起源：欧洲人群的主变异（−13910*T）与东非多个牧业人群各自的变异（如 −14010*C 等）彼此不同、独立发生，却在相似的文化环境下都升到高频——不同突变在同一性状上重复被选择，是正选择最有力的证据形式之一。其二，信号年轻而强烈：Bersaglieri 等（2004）用延伸单倍型方法在欧洲样本中定位到 LCT 区域异常长且高频的单倍型，估计选择始于数千年内，与新石器时代乳业出现的考古学时间吻合。文化实践（驯化牛、饮用鲜乳）与基因（乳糖酶持续表达）互为选择压力，构成教科书级的基因–文化协同演化案例（定性表述）。
3.6.4 瓶颈与奠基者效应
群体大小的波动在基因组上留下可读的痕迹。瓶颈效应(bottleneck effect)指群体经历规模骤减再恢复的事件：幸存者只携带原有变异的一个子样本，稀有等位（大多以单例或低频存在）率先丢失，分离位点数目锐减而杂合度下降较缓（后者近似以每代 1/(2Ne) 的速率消耗）；同时，有效大小骤降期间漂变增强、可用重组世代减少，连锁不平衡被系统性抬高、单体型块变长——这正是3.3 节提到的现象的动力学解释。相应地，奠基者效应(founder effect)指由少数个体建立新群体的事件：新群体的变异是奠基者携带的子样本，某些在源群体中罕见的等位可能在后裔群体中变成常见。
人类走出非洲的过程把这两类效应串成了一个可检验的模型——连续奠基者模型：每支迁徙队伍都只携带源群体变异的一个子样本，距东非越远，累积的奠基事件越多。由此得到一组至今仍被反复验证的预测：序列多样性（杂合度）自非洲向外递减，非洲群体拥有最高的多样性——既因非洲群体更古老、有效大小更大，也因非非洲群体的祖先在约数万年前经历了出局瓶颈；非非洲群体的连锁不平衡跨度更长、单体型块更大；距非洲越远的群体，私有（该群体特有的）等位越少，共享的单倍型越"整块"。图 3.6-4 以示意图概括这一梯度。该模型同时解释了为何以某一群体（多为欧洲裔样本）的 LD 结构设计的标签 SNP 芯片，在非洲群体中的代理能力系统性下降——这是 3.5 节关联研究中人群匹配问题的深层原因。
奠基者效应在医学上有直接映射。隔离或快速扩张的群体中，个别奠基者携带的隐性致病等位可在数十代内因漂变升至可观频率，形成所谓奠基者病（定性列举）：芬兰人群携带一系列在芬兰常见、他处罕见的隐性遗传病（"芬兰病遗产"）；宾夕法尼亚的阿米什人群中 Ellis–van Creveld 综合征等疾病的频率远高于源群体；其他经典例子还包括德系犹太人群中的 Tay–Sachs 病。与这些"漂变驱动"的高频相反，镰状细胞贫血等位在地中海与非洲部分地区的高频由杂合子优势维持——同为"群体中致病突变常见"，机制却完全不同，这对遗传筛查与咨询的含义也不同：前者适合人群特异性携带者筛查，后者提示选择平衡、频率难以仅靠筛查压低。
3.6.5 群体结构与现代人类混血
以上各小节隐含地把"群体"当作离散单元，而描述群体结构的工具大多比这更精细。群体结构(population structure)指群体内存在系统性的遗传分层。基于多位点基因型的聚类方法（STRUCTURE、ADMIXTURE）把每个个体的基因组分解为 K 个祖先成分的概率组合，个体可以是多个成分的混合；主成分分析（3.5 节）则把连续的祖先梯度压缩成低维坐标。两类方法的共同思想是：用全基因组成千上万个位点的频率差异模式来推断祖先构成，而不依赖任何预设标签。它们对现代人类给出的画像不是分立的"类型"，而是连续梯度与层叠的混合：今天的欧洲基因组包含早期狩猎采集者、安纳托利亚农民与草原牧人等多个祖先成分；美洲与大洋洲人群各自记录着多次迁徙与混合；非非洲基因组的约百分之一二来自古老人类（尼安德特人、丹尼索瓦人）的渗入（一句话带过）。混血使连锁不平衡在混合群体中重新升高、单体型块重新变长，这也被用于推断混合发生的时间。
群体不等于人种：连续谱与个体多态占绝大多数。Lewontin（1972）用当时可用的血型等经典多态位点把人类遗传多样性做了分解，得到经典结论：约 85% 的变异存在于同一群体的个体之间，群体间差异只占很小部分；基于全基因组数百万标记的现代分析给出的"组内比例"通常更高（90% 以上）。换言之，任意两个同群体个体之间的差异，平均大于两个群体平均值之间的差异；多数等位频率呈梯度渐变而非清晰边界。因此"群体"是抽样设计与统计建模的方便单元，不是类型学的"人种"。但也要避免相反的过度引申：组内占绝大多数不等于群体标签对生物学毫无意义——等位频率的梯度差异对医学（携带者筛查的群体特异性、风险模型的外推性，见 3.7 节）、法医与混血历史研究仍然重要。准确的说法是：频率有分布，边界不存在。
把本节收拢成一句话：群体遗传学给基因组科学提供了"零模型"与"偏离检测器"——HWE 是基因型层面的零模型（也是质控工具），中性理论是频率谱与分化层面的零模型（也是选择检测的背景）；而瓶颈、奠基与混合的历史事件，则把零模型的参数（Ne、θ、FST、LD 跨度）变成可读的档案。下一节将把这些档案用于最贴近应用的问题：变异如何转化为疾病风险与药物反应。
习题 3.6-3
用连续奠基者模型解释"非非洲群体的 LD 衰减尺度更长、杂合度更低"这一经验规律，并据此说明两点研究设计含义：(1) 基于欧洲群体 LD 结构挑选的标签 SNP 芯片用于非洲群体时会遇到什么问题？(2) 在非洲与非非洲群体中做关联信号的精细定位，预期的分辨率有何差别？
参考解答解释：走出非洲的每支队伍只携带变异子样本，出局瓶颈使非非洲群体起始变异更少、有效大小更小；其后到达更高频率的等位周围经历的重组世代也更少，故 LD 跨度更长、单体型块更大，而序列杂合度随地理距离递减。(1) 标签 SNP 的代理能力以 r2 为准，而 r2 依赖群体特定的 LD 结构：非洲群体 LD 更短、单体型更破碎，欧洲结构挑选的标签与致病变异的 r2 在非洲群体中系统性下降，会造成覆盖缺口与功效损失；对策是使用多群体参考面板插补或人群特异性芯片。(2) LD 长意味着关联信号峰两侧大片位点同时显示关联，置信区间宽，精细定位分辨率低；非洲群体 LD 短、多样性高，同一信号可将致病变异定位到更窄区间——这正是多样化人群测序与非洲群体关联研究的价值所在。
关键术语
- 哈代–温伯格平衡 (Hardy–Weinberg equilibrium)
- 随机交配大群体中 p2+2pq+q2=1 的基因型频率关系，一代即达、此后保持，是分型质控的零模型。
- 选型婚配 (assortative mating)
- 非随机的交配偏好（相似者相配），使杂合子频率偏离 HWE 预期。
- 瓦伦德效应 (Wahlund effect)
- 把若干各自平衡的亚群合并分析时，整体表现为杂合子不足的假象。
- 无效等位基因 (null allele)
- 引物/探针结合位点的突变使该等位不能被检出，杂合子被误判为纯合子。
- 遗传漂变 (genetic drift)
- 有限群体中抽样涨落引起的随机频率变化，强度约 1/(2Ne)，小群体中最强。
- 中性理论 (neutral theory of molecular evolution)
- 分子层面多数变异中性或近中性、命运由漂变决定的主张（Kimura, 1968），是选择检测的零模型。
- 有效群体大小 (effective population size, Ne)
- 与真实群体漂变速率等价的理想群体大小；由各代大小的调和平均给出，瓶颈时骤降。
- 位点频率谱 (site frequency spectrum, SFS)
- 分离位点按等位拷贝数的分布；扩张致稀有变体超额，瓶颈致中间频率超额。
- 固定指数 (fixation index, FST)
- (HT−HS)/HT，遗传方差中归于群体间分化的比例；离群高值提示局部适应。
- dN/dS 比值 (nonsynonymous/synonymous rate ratio)
- 非同义与同义替换速率之比：<1 纯化选择，≈1 中性，>1 正选择。
- 瓶颈效应 (bottleneck effect)
- 群体规模骤减再恢复的事件；损失稀有变异、抬高 LD、压低 Ne。
- 奠基者效应 (founder effect)
- 少数个体建立新群体致使其携带的等位（含致病等位）在后裔中升高频率。
参考文献与延伸阅读
- Gibson G, Muse SV. 2009. A Primer of Genome Science, 3rd ed. Sunderland (MA): Sinauer Associates. (Chapter 3)
- Hardy GH. 1908. Mendelian proportions in a mixed population. Science 28: 49–50.
- Weinberg W. 1908. Über den Nachweis der Vererbung beim Menschen. Jahreshefte des Vereins für vaterländische Naturkunde in Württemberg 64: 368–382.
- Kimura M. 1968. Evolutionary rate at the molecular level. Nature 217: 624–626.
- Watterson GA. 1975. On the number of segregating sites in genetical models without recombination. Theoretical Population Biology 7: 256–276.
- Lewontin RC. 1972. The apportionment of human diversity. Evolutionary Biology 6: 381–398.
- Bersaglieri T, Sabeti PC, Patterson N, et al. 2004. Genetic signatures of strong recent positive selection at the lactase gene. American Journal of Human Genetics 74: 1111–1120.
- Hartl DL, Clark AG. 2007. Principles of Population Genetics, 4th ed. Sunderland (MA): Sinauer Associates.