5.1 从基因组到蛋白质组

第五章导言把视角从序列的世界转入功能分子的世界：基因组测序回答「基因在哪里、有多少」（第 2 章），转录组测量回答「哪些基因正在被读取」（第 4 章），而细胞的绝大多数生命活动——催化、运输、信号传递、结构支撑与运动——由蛋白质执行。1994 年，Marc Wilkins 把 PROTEin 与 genOME 两词缩合，造出蛋白质组(proteome) 一词（Wilkins et al., 1996）；此后数年间，它发展为一门学科的纲领：与其一次研究一个蛋白，不如在同一实验框架内测量细胞在某一状态下「全部」的蛋白质（Tyers & Mann, 2003）。本节先界定研究对象，再论证为何转录组不能替代它，继而清点测量困难，最后给出贯穿全章的路线图。

5.1.1 蛋白质组的操作性定义

定义中「给定时间、给定条件」并非修辞。基因组在有核细胞中近乎同一套，且在个体一生中基本不改写（体细胞突变与淋巴细胞重排是例外）；而蛋白质组的组成随发育阶段、细胞周期、外界刺激、营养状态乃至亚细胞区室持续改变。把蛋白质组理解成一份静态清单是常见的误读——它更像一张随时刻改版的状态快照：同一细胞今晨与今晚的两份「清单」，差异可以大到需要当作两个样本来处理。

这一定义的历史背景是「一基因一蛋白」直觉的逐步破除：自 Beadle 与 Tatum（1941）提出「一基因一酶」、后修正为「一基因一多肽」以来，分子生物学一度默认基因与其产物一一对应；可变剪接、选择性启动子与多聚腺苷酸化、以及翻译后修饰的普遍性，最终使这一直觉只在「氨基酸序列」层面勉强成立——一个基因实际对应的是一族蛋白形式(proteoform)（Smith & Kelleher, 2013），即该基因产物因剪接变异与修饰组合而形成的每一种特定分子。

就数量级而言：人类蛋白编码基因约 2 万个（注释估计，随数据库版本略有出入）；第 4 章已述人类多数多外显子基因存在可变剪接(alternative splicing)，加之选择性启动子与不同 3′UTR，转录本异构体数已数倍于基因数；进入蛋白质层面后，每个基因产物又可携带不同组合与不同占有率的翻译后修饰，信息容量进一步放大——有估计认为人类蛋白形式总量达数十万乃至更高（数量级估计，并非计数结果）。换言之，基因组像一部约两万词条的字典，蛋白质组则是用这些词条随时刻改写而成的巨著：条目数放大一至两个数量级，且每一「词条」还带修饰标注。

5.1.2 mRNA 与蛋白质丰度的解耦

最省事的假设是「mRNA 多则蛋白多」，于是测了转录组（第 4 章）似乎就可以推知蛋白质组。1990 年代末以来的系统比较给出了否定答案：在酵母与哺乳动物细胞的全基因组尺度上，mRNA 丰度与蛋白质丰度的相关系数大多仅落在约 0.4–0.6 量级；不同研究因定量平台、基因集与动态范围处理不同而结果差异明显，对高丰度基因子集或看家基因，相关性通常更高（Gygi et al., 1999；Greenbaum et al., 2003）。定性结论是稳健的：mRNA 丰度只能解释蛋白质丰度差异的一部分，从转录组「预测」蛋白质组，误差可达数倍。

这一解耦可以用一个稳态关系式概括。设某基因的 mRNA 与蛋白质分子数分别为 M 与 P，则二者的变化服从

解耦机制其一在翻译水平。核糖体对某条 mRNA 的翻译效率受其 5′ 非翻译区（5′UTR）的二级结构、上游开放读码框(upstream ORF, uORF)以及 3′UTR 上的 miRNA 靶点等支配：稳固的 5′UTR 结构阻碍核糖体扫描起始；uORF 让核糖体在主读码框之前即被释放；miRNA 则同时抑制翻译并加速转录本降解。其结果是，同样丰度的 mRNA，蛋白产出可以相差数倍至数十倍——式 (5.1-1) 中的 k_tl 是一个被严密调控的变量，而非常数。

其二在半衰期与调控逻辑的错位。mRNA 的半衰期多为数分钟至数小时；蛋白质则从数分钟（许多调控蛋白，如 p53）到数天（不少结构蛋白）不等。更重要的是二者分工不同：mRNA 的短半衰期服务于快速响应——信号一到，转录启动，数分钟内转录本堆积，信号撤离后又迅速清除；蛋白质的长半衰期服务于功能持久。因此在任意「瞬时」取样点上，快变的 mRNA 与慢变的蛋白质天然错位：或者 mRNA 已回落而蛋白仍在（记忆效应），或者 mRNA 已飙升而蛋白尚未跟上（延迟效应）。稳态关系式只在时间尺度足够长的极限下成立，而生物学的兴趣恰恰常在非稳态。

5.1.3 翻译后修饰：同一序列，多种身份

中心法则规定了多肽链的线性序列，但蛋白质的活性、定位与寿命，在很大程度上由翻译完成之后的共价化学改动决定。翻译后修饰(post-translational modification, PTM)已注释者数以百计，本节总论其中四类最常见者，并给出理解它们的关键量——化学计量。

磷酸化(phosphorylation)由蛋白激酶把 ATP 的 γ-磷酸基转移到丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的羟基上，并由蛋白磷酸酶可逆去除。一个磷酸基引入约两个单位的负电荷，足以翻转局部构象开关或创建/破坏一个结合界面，而写入与擦除均以秒至分钟计——这使磷酸化成为信号传导的「开关语言」（Alberts et al., 2008）。人类基因组编码 500 余种蛋白激酶（约占基因数的 2%，估计值），其信息带宽可见一斑。

糖基化(glycosylation)主要见于分泌蛋白与膜蛋白：N-连接糖链起始于内质网并受折叠质检（连接位点为 Asn-X-Ser/Thr 序列子），O-连接糖链修饰丝/苏氨酸并在高尔基体加工。糖链协助折叠、介导分子识别（黏附、免疫识别等）。需要强调：糖链不是模板拷贝的产物——基因组不含糖链序列的「蓝图」，糖型由一组糖基转移酶的时空调控决定，同一蛋白因此以结构上微不均一的糖形家族存在。这既是从基因组推不出的信息，也是质谱分析的固有难点。

泛素化(ubiquitination)经 E1–E2–E3 酶级联把 76 个氨基酸的泛素共价连接到靶蛋白赖氨酸的 ε-氨基上。K48 多聚泛素链是蛋白酶体的降解信号；但泛素化并非只有「销毁」一义——K63 链参与 DNA 修复与信号转导，单泛素化调控膜蛋白运输。修饰的「语义」由链型与拓扑决定，而非由「是否修饰」决定。

乙酰化(acetylation)（N 端与赖氨酸侧链）与甲基化(methylation)（赖氨酸/精氨酸）在组蛋白上共同构成「组蛋白密码」的一部分，同时也广泛见于代谢酶，使代谢状态与基因表达得以耦合；此外还有氧化与硝化（氧化应激响应）、SUMO 化、蛋白酶切加工（酶原激活）等。这些修饰还可以组合出现于同一分子，进一步放大蛋白形式的多样性。

修饰的化学计量(stoichiometry)即某一位点的修饰占有率 θ：修饰形式分子数除以该蛋白修饰与非修饰分子总数。占有率可以是 1% 也可以是 99%——「部分修饰」意味着样品中同一蛋白的两种形式并存，总蛋白量可能毫无变化，而功能状态完全不同。

化学计量直接决定检测难度：修饰只改变个别氨基酸，不改变该蛋白绝大多数肽段的质量；修饰肽段仅占其蛋白全部肽段信号的一小部分（见习题 5.1-2），在质谱中极易被大量未修饰肽段淹没。因此 PTM 的质谱分析普遍依赖富集策略——二氧化钛（TiO₂）或固定化金属亲和色谱（IMAC）富集磷酸肽、抗磷酸酪氨酸抗体免疫沉淀、利用胰酶酶切后残留的 K-ε-GG 标签捕捉泛素化位点等。这些策略与相应的鉴定算法将在 5.3 节与5.4 节展开。

5.1.4 蛋白质组测量的技术困难

基因组计划的成功，在工程上依赖 DNA 分子的两项「好性质」：可互补杂交、可体外扩增。蛋白质恰好都不具备。表 5.1-1 从测量角度对照这两类分子，其后各段展开最关键的四条困难。

动态范围是第一条也是最严酷的一条。同一份血浆中，白蛋白浓度约数十 mg/mL，而许多细胞因子仅 pg/mL 量级，跨度约 10 个数量级（Anderson & Anderson, 2002）；组织裂解物较窄，通常也有 6–8 个数量级。任何单一检测器的线性响应范围都远窄于此，于是「为看清高丰度蛋白而调好的条件，必然看不见低丰度蛋白；为低丰度蛋白放大的信号，必然被高丰度蛋白淹没」。

第二条是两类「结构性看不见」的蛋白。跨膜蛋白含多段疏水螺旋，提取需去污剂，溶解性与回收率都差，而它们恰是信号传导与药物靶点的富集区域；低丰度调控蛋白（激酶、转录因子）每细胞可能仅数十至数千个分子，常规染色与数据依赖采集均难以覆盖。第三条与第四条更为根本：蛋白质没有 PCR 等价物——DNA 可以指数扩增把痕量变成可测量，而蛋白质的酶切与电离都不增加分子数，灵敏度因此受样品原始丰度的硬约束；蛋白质之间也不存在 Watson–Crick 式的通用互补配对，第 4 章表达阵列赖以工作的「探针杂交」思想对蛋白质整体失效。于是蛋白质的「身份识别」只能退回到物理化学分离（电泳与色谱）加上精确质量测定与数据库比对的组合——这一差异决定了本章后续全部技术的面貌。

5.1.5 三大研究模式与本章路线图

把上述问题汇总，蛋白质组学的研究实践可以归为三问。其一，表达谱（expression proteomics）：谁在、有多少——确定样品中蛋白的身份与丰度；其二，相互作用（interaction proteomics）：与谁结合——确定蛋白如何组装成复合体与网络；其三，结构与修饰：以何种形态存在——确定蛋白的构象状态与修饰谱。三问对应的技术主干不同，但共享同一套分离—质谱—检索的基础设施。

本章即沿「分离—称重—鉴定—定量—成网」的顺序展开：5.2 节二维凝胶电泳，以等电点与分子量两个正交坐标为蛋白质「建档」；5.3 节质谱技术基础，从软电离到串联质谱，解决「称重与读序」；5.4 节肽质量指纹与数据库检索，把质量还原为身份；5.5 节定量蛋白质组学，比较不同状态间「多少」的变化；5.6 节蛋白质相互作用与生物网络，把一份份蛋白清单连成细胞运行的「关系图」。本章的所有技术细节，最终都服务于把本节的三问回答得更多、更准、更快。