5.4 蛋白质鉴定：肽质量指纹与数据库检索

5.3 节介绍了肽段离子的质荷比测量和串联质谱碎片信息。由这些观测推断肽段序列，再确定可能的来源蛋白，需要结合数据库、酶切规则、谱图打分与误差估计。本节依次讨论这几个环节：肽质量指纹以多个质量匹配支持候选蛋白；串联质谱增加序列约束；统计校准确定一组鉴定结果中可能有多少错误；蛋白推断则处理同一肽段对应多个蛋白的问题。以下以经典方法说明这些计算步骤及其假设（Gibson & Muse, 2009）。

5.4.1 肽质量指纹图谱（PMF）

1993 年，Henzel、Pappin 等课题组提出并验证了依据酶切肽段质量检索蛋白质序列的方法（Henzel et al., 1993；Pappin et al., 1993）。对于经二维凝胶（5.2 节）分离、主要含一种蛋白质的斑点，一组精确质量可以为数据库中的候选提供鉴定证据，而不必先测出肽段的完整序列。这一路线称为肽质量指纹图谱。

以凝胶斑点鉴定为例，PMF 包括以下四个步骤（图 5.4-1）：

1. 斑点切取与胶内酶切：切下目标斑点，还原二硫键并烷基化半胱氨酸，再用胰蛋白酶(trypsin)酶切。常用检索规则是在 Lys（K）或 Arg（R）的 C 端侧切割，其后紧邻 Pro 时不切；这是理论酶切的规则，实际产物仍可能含漏切或非特异性切割。肽段长度与质量分布取决于序列和消化条件，不能由酶名称指定一个固定范围。
2. 质量测量：MALDI-TOF 检测可观测的肽段离子，常见形式为单电荷 [M+H]⁺。其 m/z 数值对应中性肽段质量 M 加一个质子的质量；比较实测与理论值时必须采用相同的质量约定。离子化效率、峰重叠及检测范围等因素会使部分酶切产物没有可用信号。
3. 数据库理论酶切：按指定规则枚举候选蛋白的肽段，即理论酶切(in silico digestion)。对于未修饰的线性肽，中性质量等于残基质量之和加一分子水；计算 [M+H]⁺ 时再加一个质子的质量。检索还可允许一定数量的漏切位点(missed cleavage)，例如每条肽段至多 1–2 个，以纳入规则切割位点未断裂形成的较长肽段。具体上限应与样品处理和检索目的相符。
4. 匹配与打分：在给定质量容差内比较实测与理论质量，为候选计算匹配得分。序列覆盖率(sequence coverage)是匹配肽段覆盖的残基占候选全长的比例，可与质量误差分布、分子量及等电点等信息一起用于核查结果。

匹配计数需要进一步转化为统计证据：在无关候选中，类似程度的匹配有多常见？MOWSE 利用肽段质量在数据库中的频率分布对 PMF 匹配加权（Pappin et al., 1993）。Mascot 采用概率打分，并以对数形式表示匹配证据（Perkins et al., 1999）：

按式 (5.4-1)，得分 80 对应模型中的 P = 10⁻⁸；这仍需结合该次检索的候选规模和显著性阈值解释，不能统一采用 60 或 70 分作为鉴定界限。还应检查覆盖区域、质量误差、理论分子量与 pI 是否与凝胶位置相符，以及角蛋白、胰酶自切等峰是否影响匹配。Mascot 打分文档区分了匹配得分、期望值和显著性阈值。PMF 适合较简单的蛋白质样品；复杂混合物中，每种蛋白可用的匹配质量可能较少，不同来源的峰又会增加候选歧义。数据库缺少相应序列、未纳入的修饰或序列变异也会妨碍鉴定。串联质谱通过增加碎片的序列约束，缓解仅依赖质量集合的这些局限。

5.4.2 串联质谱的序列证据

PMF 利用肽段的质量集合，串联质谱则进一步提供序列约束。如 5.3 节所述，碰撞诱导解离（CID）常产生保留 N 端的 b 离子和保留 C 端的 y 离子。对于同一离子系列、相同电荷态且对应相邻断裂位置的两个碎片，m/z 差等于新增残基质量除以电荷数 z；在单电荷情况下，该差值才直接等于残基质量。实际谱图可能缺峰或混有其他类型离子，不能把任意相邻峰都解释为一个残基。

从头测序(de novo sequencing)直接利用碎片信息推断肽段序列，不以数据库中的已有肽段作为必需候选。在理想的单电荷 b 离子阶梯中，按碎片长度递增读取质量差，可沿 N 端至 C 端确定新增残基；y 离子阶梯的对应方向则相反。实际算法需要在缺峰、噪声和多种碎片解释之间比较可能的序列路径，输出全序列或有置信度限制的局部序列。对于序列数据库不完整的物种，这些结果还可用于近缘物种的同源检索。Leu 与 Ile 的残基质量相同，因此仅靠常规 b/y 质量阶梯不能区分二者。

序列标签(sequence tag)检索将局部读序与数据库匹配结合起来（Mann & Wilm, 1994）。标签由一段可靠的短序列及其前、后区域的质量约束组成，例如图 5.4-2B 的三残基标签。检索时同时检查候选序列和两侧质量，通常比只用相同长度的短序列约束更强。其判别力取决于标签长度、质量容差与数据库组成，不能保证候选一定缩减到固定数量。原方法还可通过允许标签外区域的质量差来处理部分修饰或序列替换；这需要相应的容错规则，标签内部的错误或未建模变化仍可能使检索失败。

5.4.3 数据库检索算法与假发现率控制

大规模实验可产生 10⁴–10⁵ 张或更多 MS/MS 谱图，需要自动化检索。算法先按前体质量、酶切和修饰条件筛选候选肽段，再比较候选与实测谱的相符程度。SEQUEST 和 Mascot 分别说明相关打分与概率打分的基本思路。

相关打分：SEQUEST。算法依据候选序列和碎裂规则构造理论谱，包含预期的 b/y 离子及所设定的其他碎片。经典 SEQUEST 先用初步得分筛选候选，再计算交叉相关(cross-correlation, XCorr)：比较实测谱与理论谱在零位移时的相关程度，并扣除沿 m/z 轴平移所得的平均背景相关（Eng et al., 1994；Yates et al., 1995）。初步得分并非单纯的共有峰数，XCorr 也不只是判断图形外观；谱图预处理、峰强度和碎片匹配共同影响结果。噪声或缺峰仍可能降低正确候选的得分。

概率打分：Mascot。在 MS/MS 检索中，软件为每个谱图—肽段匹配（peptide-spectrum match，PSM）计算离子得分，以式 (5.4-1) 的对数形式表示随机匹配模型下的证据强度（Perkins et al., 1999）。这是基于零假设的显著性打分，不能直接解释为“候选为真”的贝叶斯后验概率。蛋白得分还需按软件规则汇总肽段证据，也不能不经校准便当成蛋白正确的概率。最佳匹配仅表示候选中得分最高；它是否足够显著，需要另行判断。

检索参数定义了搜索空间。除了前体质量窗口，酶切规则和漏切上限决定哪些肽段可以成为候选。固定修饰(fixed modification)假定所有指定残基或端基均带有该修饰，例如在相应样品处理成立时，将 Cys 的氨甲酰甲基化（+57.021 Da）设为固定修饰。可变修饰(variable modification)允许指定位点处于修饰或未修饰状态，例如磷酸化（+79.966 Da）或甲硫氨酸氧化（+15.995 Da）。若 m 个位点各有两个可独立选择的状态，且不限制修饰总数，组合数为 2^m；实际检索还会受前体质量、修饰数上限和允许组合的约束。

谱图数量增加时，需要处理多重检验。例如，对 10 万张真实序列均无法正确匹配的谱图，若每张被错误接受的概率为 10⁻³，则错误接受的期望数为 100；若其中部分谱图有正确候选，这个计算就不能直接套用。假发现率（FDR）关注的是所接受结果中错误比例的期望：若 R 个报告结果中有 V 个错误，则 \(\operatorname{FDR}=\mathbb{E}[V/\max(R,1)]\)。它不是每一条结果的后验错误概率。目标—诱饵策略(target-decoy strategy)利用人工构造的错误候选，为这一集合层面的误差提供估计。

分开搜索需要另一套校准。若每张谱图分别保留最佳目标和最佳诱饵，两者没有竞争；正确目标匹配对应的谱图也可能产生过阈值诱饵，因此这些计数不能直接套入式 (5.4-2) 的竞争口径。Käll 等（2008）讨论了以分开搜索构造经验零分布并估计混合比例的方法；Keich 等（2015）进一步分析了简单比例校正的偏差。相关比例参数描述的是所分析的谱图或匹配集合，定义须服从具体模型。Mascot 作者文档也明确区分经验零分布方法与 TDC。检索时物理上使用一个还是两个文件，并非唯一判据，关键还在于每张谱图是否进行目标—诱饵竞争，以及后续如何校准。

阈值、样本量与鉴定层级均需注明。阈值升高时 D、T 都不会增加，但 D/T 可能波动，并不保证单调下降；q 值可表示能保留某条结果的阈值中最小的估计 FDR（Käll et al., 2008）。诱饵计数很少时估计不稳定，D = 0 也不证明没有错误，阈值选择和有限样本处理应遵循所用方法。PSM FDR 计算谱图匹配，肽段 FDR 则需定义如何合并重复谱图、是否区分修饰状态，并在合并后重新校准；蛋白或蛋白组 FDR 还涉及蛋白打分与推断。将 PSM 去重不保证保留同一 FDR，更不能由 PSM 层面的 1% 直接推出肽段和蛋白均为 1%。这些批量 MS/MS 结果的估计也不能直接用于一份 PMF 指纹。

5.4.4 从肽段到蛋白的推断问题

MS/MS 检索最初产生的是PSM，同一条肽段可以被多张谱图重复支持。把这些匹配汇总成肽段，再推断来源蛋白，需要处理共享肽段(shared peptides)：同一序列可能出现在同源蛋白、剪接异构体或含共享结构域的不同条目中。一条 A/B 共有肽段支持“至少有一个相容来源”，却不能单独判断 A、B 是否分别存在。唯一肽段(unique peptides)在所选数据库与序列判别约定下只对应一个候选条目，可提供更直接的区分证据；这种唯一性随数据库和 L/I 等歧义处理而改变。共享肽段仍能限制候选集合，并非没有鉴定信息。

简约蛋白推断(parsimonious protein inference)是一类常用方法：在候选映射固定、接受肽段视为正确证据的前提下，寻找能解释全部肽段的最小蛋白集合，即集合覆盖问题（Nesvizhskii & Aebersold, 2005）。图 5.4-4 中，P1 只对应 A，P4 只对应 C，因此任何覆盖都包含 A、C；二者也解释了 P2、P3，无需再加入 B。但“最小解释不需要 B”不能证明样品没有 B。若候选具有完全相同的已观测肽段证据，可以按不可区分蛋白组（protein group）报告；其他共享或子集关系则需注明具体分组规则。报告还应列出唯一与共享肽段证据，并单独说明蛋白或蛋白组层面的 FDR。鉴定错误与来源歧义是两个问题：即使肽段序列正确，也可能无法确定具体异构体。

5.4.5 工作流、数据标准与检索库

鸟枪法蛋白质组学(shotgun proteomics)以复杂样品酶切后的肽段为主要测量对象。以数据依赖采集（DDA）为例，工作流依次为：样品制备与酶解 → 液相色谱分离肽段 → 选择前体离子并采集 MS/MS → 数据库检索与 PSM 打分 → 按指定鉴定层级评估 FDR → 肽段汇总与蛋白推断。其他采集方式需配套相应的检索和校准方法。定量还需要汇总肽段的丰度证据，见5.5 节。与二维凝胶路线相比，两者的主要区别在于分离和测量的层级。

开放数据标准帮助保存可交换的测量与分析信息。mzML 用于表示质谱数据及相关采集信息（Martens et al., 2011）；mzIdentML则用于表示鉴定过程和结果，包括所用数据库、检索参数、PSM 及蛋白推断。两者的用途需要区分。PRIDE Archive作为 ProteomeXchange 成员，提供质谱蛋白质组学数据的保存和访问。提交原始数据、处理结果、搜索参数与样品元数据，才能为结果复核和再分析提供必要依据。这里的数据标准与资源说明包含原书 2009 年出版后的进展。

检索库决定了可以提出哪些候选。UniProtKB分为人工审校的 Swiss-Prot 与尚未完成全面人工审校、以计算注释为主的 TrEMBL。选择数据库时，应先考虑物种、参考蛋白质组、需要区分的异构体以及常见污染物；人工审校状态不能替代对候选覆盖的判断。过小的库可能缺失真实序列，扩大库则会增加竞争候选和统计校准负担。报告应记录数据库版本、序列筛选与诱饵构建方法；若调整数据库或搜索规则，应重新评估最终结果，而不直接沿用原阈值。蛋白质身份及其歧义明确之后，下一节将讨论如何比较丰度。