3.2.1 从抗体到标签：ADT 的化学构成
3.1 节的质谱流式把读数的担子交给金属同位素：每种抗体拖一颗稀土标签，仪器按质量分辨。CITE-seq 换了一种标签——寡核苷酸。亲和测量的前提没有变：抗体的抗原结合部位识别靶蛋白上的表位(epitope)，特异性由这一步决定；变的只是"读出"。
而读序列恰是当代仪器最擅长的动作：一次运行可产生数亿条读数，成本低廉，还与单细胞转录组文库天然兼容。把蛋白信号翻译成核酸分子，蛋白测量就能搭上测序这条现成的高速公路——这是 CITE-seq(cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing)（Stoeckius et al., 2017）与同期 REAP-seq（Peterson et al., 2017）的共同出发点。
偶联的化学并不复杂。经典做法先做生物素化(biotinylation)：抗体的 Fc 端共价连接若干生物素分子，标签寡核苷酸的 5′ 端也带生物素；链霉亲和素(streptavidin)有四个生物素结合位点，一边抓抗体、一边抓寡核苷酸，把两者桥接成牢固的复合物，产物中寡核苷酸与抗体的分子比控制在接近 1:1（Stoeckius et al., 2017）。共价偶联是替代路线——例如经 NHS 酯或点击化学直接连到赖氨酸侧链，商用试剂多走这类工艺。无论哪条路线，反应条件都要避开抗体的抗原结合部位：偶联伤了 Fab，特异性与滴度便一起受损。
抗体衍生标签（antibody-derived tag, ADT）：经生物素-链霉亲和素桥接或共价化学挂接在抗体上的寡核苷酸，由三段构成——5′ PCR 手柄（文库扩增的引物位点）、抗体条码（指认蛋白种类）、3′ poly(A) 尾（供微珠捕获）。它把"抗体的特异性"与"测序的读出"接到同一分子上：结合决定测谁，条码决定读出后记到谁名下。
标签本身是一段总长数十个核苷酸的 DNA，按功能分三段（图 3.2-1A）。5′ 端是 PCR 手柄，即文库扩增的引物结合位点；中段是抗体条码，一段十余个碱基的特异序列（量级），每种抗体唯一，测序读的正是它；3′ 端是 poly(A) 尾，一段连续的腺嘌呤，作用留到 3.2.2 揭晓。抗体条码的注释不在序列数据库里，而在实验设计里：条码对应哪种蛋白，由加入的抗体先验给定。这与 mRNA 读段须比对到参考基因组才能命名根本不同——亲和路线"测什么"在实验设计阶段已经锁定，覆盖受限于抗体组合，其化学根源正在此处。
3.2.2 同一颗微珠：蛋白与转录的共捕获
液滴式平台的核心是凝胶微珠(gel bead)：每颗微珠上固定着数十万条序列相同的 oligo，从 5′ 到 3′ 依次是读段引物位点、细胞条码(cell barcode)、统一分子标识符(unique molecular identifier, UMI)与 poly(dT)。细胞、微珠与试剂经乳液包裹进同一个液滴；细胞裂解后，胞内 mRNA 凭 poly(A) 尾与微珠 oligo 的 poly(dT) 互补退火。ADT 的 3′ 端同样带 poly(A) 尾——它就这样混进同一条捕获通道：标记在细胞表面的 ADT 随细胞进液滴，无论此后是否还连着抗体，poly(A) 尾都指向同一个捕获端，与 mRNA 一道被同一颗微珠抓住（图 3.2-1B）。共用捕获端让现有 3′ 平台不必任何改造；代价是标签的捕获序列必须与试剂盒化学严格匹配，换平台须重新设计（商用试剂为此分列型号）。
逆转录之后，两条链路分家：cDNA 文库与 ADT 文库用不同引物分开扩增——ADT 片段短，靠 5′ PCR 手柄富集成独立的小文库。但两个文库的每条读段带同一套结构：细胞条码给出地址，UMI 标记原始分子，中段才是内容（基因或抗体条码）。UMI 在这里承担去重：PCR 把一个分子放大成成千上万个拷贝，相同 UMI 的拷贝只计一次，计数单位因此回到"分子"而非"读数"。测序完成后，按条码来源把读段拆成基因表达矩阵与 ADT 计数矩阵，两个矩阵的行对齐到同一批细胞——3.4 节的联合建模，物理基础就是这一步。
测量的语义值得写清楚。把细胞 i 中 ADT j 的 UMI 计数记为 cij，它可近似拆成信号与背景两项：
因此 ADT 计数是表位占有量(epitope occupancy)的代理，不是蛋白分子数。表位密度、抗体亲和力、染色浓度与时间共同决定 s；换一个克隆，尺度就换一套。跨蛋白的 ADT 强度不可比（正如质谱里跨肽段的峰面积不可比），同一 ADT 在细胞之间才谈得上相对定量。占有量代理还有一个推论：表位被占满后信号不再随拷贝数增长，顶端被压平——这是动态范围窄的机理之一（3.2.4）。
ADT 读数是占有量的代理，不是分子数。计数正比于"结合上的抗体分子数"，受抗体亲和力、染色条件与表位可得性调制；换克隆即换尺度。把 ADT 强度直接当蛋白拷贝数解读，或跨蛋白比较强弱，都是把代理量当成了本尊——跨样品比较也须以统一滴定与归一化为前提。
3.2.3 三层条码与细胞混样
一次 CITE-seq 实验里，"这条读段是谁的、测的是什么"由几层条码接力回答（表 3.2-1）。细胞条码在微珠上，回答"哪个细胞"；抗体条码在 ADT 上，回答"哪种蛋白"；文库条码在文库扩增引物上，回答"哪个文库、哪次运行"。UMI 介于其间，回答"哪一条原始分子"。各层独立设计：细胞条码从数百万种组合里为每颗微珠分配一种，抗体条码每种抗体一种，文库条码每个文库一种。
| 条码层 | 所在位置 | 回答的问题 | 典型来源与规模 |
|---|---|---|---|
| 细胞条码（cell barcode） | 微珠 oligo 中段 | 哪个细胞 | 数百万种组合，每颗微珠一种 |
| UMI | 微珠 oligo 3′ 端 | 哪一条原始分子 | 随机短序列，供 PCR 去重 |
| 抗体条码 | ADT 中段 | 哪种蛋白 | 每种抗体唯一，先验指定 |
| 样品条码（hashtag） | 混样抗体的标签中段 | 哪管样品 | cell hashing，每管一种 |
| 文库条码 | 文库引物 / index | 哪个文库、哪次运行 | 每个文库一种 |
第三层条码还有一种更主动的用法：细胞混样条码(cell hashing，保留原名)。做法（Stoeckius et al., 2018）：选一组泛表达、高表达的表面标志——CD45、CD44、CD98、β2 微球蛋白都在原始论文的名单上——把这些抗体各自接上一种 hashtag 寡核苷酸，结构与 ADT 同款，只是条码指认的不是蛋白而是"样品管"。每管细胞单独染一种 hashtag，然后把几管细胞混成一管，同通道上机。
解卷积(demultiplex)在测后逐细胞读 hashtag 组成。单一 hashtag 显性，细胞归入该样品；两种 hashtag 相当，判为双联体(doublet)——两个细胞进了同一液滴，正是液滴平台要防的假象；各 hashtag 全都低而平，多半是无细胞液滴只装了环境里的弥散标签，随空液滴一并剔除。一套条码同时买到两样东西：双联体检测与样品多重标记(multiplexing)——后者让多个样品共享一条通道，既省成本，也把"样品"与"批次"两个变量解耦。
细胞混样条码（cell hashing）：用针对泛表达表面标志（CD45、CD44、CD98、β2 微球蛋白等）的寡核苷酸抗体，在混样前给每管细胞打上专属样品条码（hashtag）；测序后按 hashtag 组成解卷积，一并完成样品多重标记与双联体检测（Stoeckius et al., 2018）。
习题 3.2-1
四管细胞分别染 hashtag HT1–HT4 后混样上机。三个液滴的 hashtag UMI 计数（已去重）与 RNA UMI 总数如下：
液滴 A：HT1=182，HT2=9，HT3=6，HT4=11；RNA 总数 21,400。
液滴 B：HT1=104，HT2=121，HT3=8，HT4=13；RNA 总数 39,800。
液滴 C：HT1=14，HT2=17，HT3=19，HT4=15；RNA 总数 40（其余液滴均在 2 万上下）。
（a）判定三个液滴各属哪种情形（单细胞、双联体或空液滴），写出判据。（b）若把液滴 B 判为样品 1 的单细胞并入矩阵，下游分析会出现什么后果？（c）为什么 hashtag 要选泛表达、高表达的标志物，而不是细胞类型特异标志物？
参考解答（a）A：HT1 显性（次高 11，主/次比约 16 倍，其余为噪声），判为样品 1 的单细胞。B：HT1 与 HT2 相当（104 对 121），其余低平，判为来自样品 1 与样品 2 的异源双联体，剔除；其 RNA 总数接近其他液滴的两倍，佐证两个细胞。C：四种 hashtag 同低而平，RNA 总数极低，判为无细胞液滴，计数来自环境弥散标签，剔除。（b）双联体的基因表达是两个细胞之和，几乎所有基因的计数抬高近一倍；它会以"高 RNA 总量、混合表达谱"的假群体进入降维与聚类，拉伸主要成分、污染近邻图，并在样品间差异分析中制造假差异。（c）特异标志物只在部分细胞上表达，阴性细胞拿不到 hashtag 信号，无法指认样品；泛表达、高表达的标志保证每个细胞都有明确且同一量级的样品标签，判据才统一、阈值才好定。
3.2.4 ADT 信号的特点：双峰、背景与归一化
ADT 数据的分布形态与 RNA 显著不同，三点最要紧：
- 动态范围(dynamic range)窄：mRNA 计数跨四到六个数量级，ADT 强度常只跨约两个数量级（量级）——表位数目有限、结合会饱和，顶端压平（图 3.2-2B）。
- 典型双峰：阴性峰（非特异结合加背景）与阳性峰（真实表位表达）各居一端，多数标志物的直方图一眼可辨（图 3.2-2A）。
- 几乎无随机缺失：低表达基因在单细胞转录组里因捕获率低而大量记零，ADT 则每个细胞都有读数，"零"几乎不出现（图 3.2-2B）。
第三点值得细看。scRNA-seq 的缺失主要是采样问题：捕获率有限，分子少的基因在部分细胞里一个也逮不到，泊松涨落给出真实的零。ADT 不受此限：抗体结合在染色步骤已经完成，每个被结合的标签都会经捕获放大读出，信号下限不由采样决定，而由环境背景(ambient background)托底——阴性细胞记到的不是零，而是背景。数据处理的重心因此从"补缺失"挪到"扣背景"，这与第 4 章 RNA 侧的缺失值填补形成鲜明分工。
背景的来源主要是两类：未结合靶标、游离在悬液里的 ADT 随细胞一起进液滴；乳液中无细胞液滴记录到的弥散条码。两者叠加成一条低而平的背景分布（图 3.2-2A 虚线）。滴定(titration)就是在这条底噪与阳性峰分离度之间找平衡：浓度不足，弱阳性群体沉入背景；浓度过高，背景整体抬升，阴性峰右移，双峰反而并拢。
滴定：逐抗体确定染色浓度的工作点。以分离度为目标——按浓度阶梯染色，测各浓度的阴/阳峰参数，取分离度最大的浓度，而非信号最强的浓度。浓度不足，弱阳性沉入背景；过量则背景抬升、双峰并拢（习题 3.2-2 给出数值例子）。滴定规程也是跨批次、跨实验室可比性的基础。
习题 3.2-2
某表面标志的 ADT 强度（CLR 之前的线性标度，任意单位）：阴性峰 μ− = 30、标准差 σ− = 6；阳性峰 μ+ = 300、σ+ = 60。参照流式细胞术常用的分离度定义 D = (μ+ − μ−)/(2σ+ + 2σ−)。（a）计算 D。（b）把抗体浓度提高一倍后复测：μ− = 60、σ− = 12；μ+ = 320、σ+ = 64（表位接近饱和）。再算 D，并据此说明滴定浓度是否越高越好。（c）若背景处理把 μ− 降到 20 而 σ− 与阳性峰不变，D 变为多少？由此说明"先扣背景、再定阈值"的次序依据。
参考解答（a）D = (300 − 30)/(2×60 + 2×6) = 270/132 ≈ 2.05。（b）D′ = (320 − 60)/(2×64 + 2×12) = 260/152 ≈ 1.71，小于 2.05。浓度加倍后阳性峰几乎不动（表位饱和），背景却同步抬升，两峰并拢——滴定的目标是分离度最大，不是信号最强。（c）D″ = (300 − 20)/132 = 280/132 ≈ 2.12，大于 2.05。压低背景等效于拉开两峰，这就是先做背景处理、再定门控阈值的次序依据。
归一化要照顾上述结构。最常用的中心化对数比(centered log-ratio, CLR)对每个细胞单独做：
CLR 不跨细胞比较总量，恰与"跨蛋白不可比"的性质相配。此外还有利用空液滴与阴性对照蛋白估计背景、再逐细胞扣除的做法，思路与式 (3.2-1) 的 b 项直接对应。这些背景扣除与归一化的选择并非细枝末节：把它们当作可替换的流程要素、按数据特点导航选优，正是第五章 ANPELA 一类工具处理细胞计数类蛋白组数据的入口（Zhu et al., 2025）。
习题 3.2-3
（a）解释为什么 scRNA-seq 中低表达基因常出现精确的零值，而 ADT 几乎不给零值。（b）CLR 为何要在"每个细胞内部"取几何中心，而不是像 RNA 常用的那样除以该细胞的总计数？（c）一个只测 3 种 ADT 的小组合能用式 (3.2-2) 吗？会遇到什么问题？
参考解答（a）RNA 的捕获与测序是低效采样，分子数少时泊松涨落给出真实的零；ADT 的结合事件在染色阶段已经完成，捕获放大近乎完全，下限由环境背景托底，"无信号"表现为低背景计数而非零。（b）ADT 计数总和没有"细胞总量"的自然含义——组合是人为选定的，且跨蛋白不可比；除以总和会把组合的变化误当细胞差异。几何中心化只去掉乘性尺度、保留相对格局，与该数据性质相配。（c）能算但极不稳：p = 3 时，均值由另外两种 ADT 主导，任何一种的涨落或异常都会剧烈牵动其余两种的中心，噪声被放大；实践中组合需足够大（数十种以上）CLR 才稳定。
3.2.5 平台谱系与组合规模
平台谱系很短。主力是液滴式：10x 类平台把 3′ 转录组与 ADT 装进同一次运行，每通道数千至上万个细胞（量级），蛋白与转录的矩阵天然配对。板式与微孔方案（如 BD Rhapsody 一类）同样支持寡核苷酸抗体，以孔-珠匹配代替乳液，通量略低、背景结构略有不同，本节不展开商品对比。思想同源的工作也不止一家：REAP-seq 与 CITE-seq 同年发表（Peterson et al., 2017），同样以抗体-寡核苷酸加液滴读出，演示了八十余种蛋白的组合（量级）。
组合规模的演进更能说明瓶颈所在。原始论文用 13 种抗体测了 8,617 个脐血单个核细胞（Stoeckius et al., 2017）；如今商用寡核苷酸抗体总组合已达数百种（量级）。条码空间本身近乎无限——数百万种细胞条码组合、随手可设计的抗体条码，都远未用满；真正的约束在试剂端：每种新抗体都要验证特异性、确定滴度、并通过与现有组合的串扰测试，三者共同决定组合扩张的速度。对照质谱流式：金属通道受纯同位素供给限制，奠基工作时一次测 34 个参数（31 种抗体，余为 DNA 含量、活性与事件长度）（Bendall et al., 2011）；CITE-seq 把这层限制挪走了，代价转移给抗体质量与滴定规程。
- 2011质谱流式问世：金属同位素标签，一次测 34 个参数（Bendall et al., 2011）。
- 2017CITE-seq 与 REAP-seq 同年发表：抗体-寡核苷酸把表面蛋白送进测序仪（Stoeckius et al., 2017；Peterson et al., 2017）。
- 2018cell hashing：样品条码一举两得——多重标记与双联体检测（Stoeckius et al., 2018）。
- 至今商用寡核苷酸抗体组合达数百种（量级）；配对的蛋白-转录数据成为联合建模的常规入口（3.4 节）。
3.2.6 误差与局限
误差清单也围绕抗体展开。非特异结合抬高背景：Fc 段与表达 Fc 受体的细胞（单核、巨噬一类）结合尤其常见，染色前以免疫球蛋白封闭是常规对策；阴性峰的峰位因此会随样品构成移动，门控阈值须一并复核。
表位可得性受样品处理影响：组织酶解可能剪切表面蛋白，固定与通透改变表位构象——胞内靶标的测量难度因此更高。抗体批次差异是慢性病：同一克隆不同批次的滴度与非特异水平都会漂移，跨实验室的可比性依赖统一的滴定规程与固定的抗体组合。
最后是预算约束：测序读数在 RNA 与 ADT 两个文库之间分配。ADT 靶点少、文库简单，每细胞数千条读数即可接近饱和（量级）；RNA 要每细胞数万条才够展开转录组。把读数过多拨给 ADT，换来的只是重复计数；拨得太少，UMI 去重不稳。读数分配因此是实验设计参数，不是测后可以补救的量——这一预算观与质谱路线"仪器时间即预算"的思路同构（Lin et al., 2024）。
本节把"用测序读出表面蛋白"拆成化学、条码、信号三层机理：
- 化学：ADT = PCR 手柄 + 抗体条码 + poly(A) 尾，经链霉亲和素桥接或共价偶联挂上抗体；特异性仍来自抗原-抗体结合，测序只负责读条码、数分子；
- 条码：细胞条码、抗体条码、文库条码三层接力，UMI 去重让计数回到分子；cell hashing 把样品条码变成混样与双联体检测的工具；
- 信号：动态范围窄、典型双峰、无随机缺失而有环境背景——归一化（CLR 等）与门控的对象因此与 RNA 不同，流程要素的选优留给第五章。
3.3 节把 CITE-seq 与质谱流式、质谱路线放进同一个决策框架，检验各自适合的生物学问题。
关键术语
- 抗体衍生标签 (antibody-derived tag, ADT)
- 挂接在抗体上的寡核苷酸，含 PCR 手柄、抗体条码与 poly(A) 尾三段。
- 表位 (epitope)
- 抗体抗原结合部位识别的靶蛋白表面结构，特异性的来源。
- 链霉亲和素 (streptavidin)
- 四价结合生物素的蛋白，把生物素化抗体与生物素化寡核苷酸桥接。
- 细胞条码 (cell barcode)
- 微珠 oligo 中指认细胞身份的序列，每颗微珠一种。
- 统一分子标识符 (unique molecular identifier)
- 标记原始分子的随机短序列，供 PCR 拷贝去重。
- 细胞混样条码 (cell hashing)
- 以泛标志寡核苷酸抗体给整管样品打样品条码，混样后解卷积。
- 双联体 (doublet)
- 两个细胞进入同一液滴形成的假观测，可由 hashtag 组成检出。
- 环境背景 (ambient background)
- 游离 ADT 与弥散条码形成的低平计数分布，托起信号下限。
- 滴定 (titration)
- 逐抗体确定染色浓度的工作点，目标为分离度最大而非信号最强。
- 中心化对数比 (centered log-ratio)
- 细胞内取对数后减去几何中心的 ADT 归一化方法（CLR）。
参考文献与延伸阅读
- Stoeckius M, Hafemeister C, Stephenson W, Houck-Loomis B, et al. 2017. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods 14: 865–868.
- Peterson VM, Zhang KX, Kumar N, et al. 2017. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology 35: 936–939.
- Stoeckius M, Zheng S, Houck-Loomis B, et al. 2018. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology 19: 224.
- Bendall SC, Simonds EF, Qiu P, et al. 2011. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science 332: 687–696.
- Lin HJL, Webber KGI, Nwosu AJ, Kelly RT. 2024. Review and practical guide for getting started with single-cell proteomics. Proteomics 25(1–2): e202400021.
- Zhu F 团队（IDRB Lab，浙江大学）. 2025. Navigating the data processing for cytometry-based single-cell proteomics. Nature Protocols.