4.1 定量矩阵的解剖：PSM、肽段与蛋白

摘要　单细胞质谱数据的原始形态并不是一张细胞×蛋白的矩阵，而是一叠以肽段-谱图匹配为行的宽表和一张注释表。本节以 SCoPE2 公开子集（4 个 run、16 通道 TMT）为例，解剖定量矩阵的三层结构——PSM、肽段、蛋白——与两次中位数归并的机理及代价，随后建立三项质控指标：样品/载体比、中位变异系数与缺失率，并把缺失视为采集与制备过程的内生属性，为全章流程铺定坐标。

4.1.1 数据的起点：run、通道与两份输入表

第 3 章结束时，细胞已完成分选、酶解与 TMT 标记。数据处理的第一课，是认清起点：手里没有"细胞×蛋白"的矩阵，只有两份表——搜索引擎输出的 evidence 表（教程数据 1,362 行 × 150 列）与注释表(sample annotation)（65 行 × 7 列，首行为表头即 64 条通道记录）。数据取自 SCoPE2 子集：U-937 单核细胞与经 PMA 分化的巨噬样细胞，一种细胞系、两种状态（Specht et al., 2021；Gomoryova and Hecht, 2025）。

实验的组织方式决定了表的形状。一次单细胞 TMT 实验等于多次独立的液相-质谱联用采集(run)：每个通道组单独上柱、走梯度、采集。同一个 run 的 16 个通道(channel)共享同一段梯度与同一套质量校准，跨 run 的通道之间隔着一次重新进样。教程数据共 4 个 run、每 run 16 个 TMT 通道，合计 64 个。

evidence 表的一行是一次肽段-谱图匹配(peptide-spectrum match, PSM)：一张二级谱图配一条肽段序列（鉴定视角见 1.4 节）。150 列里多数是鉴定元数据——修饰后序列、蛋白归属、电荷、保留时间、母离子纯度、q 值；其中 16 列是报告离子(reporter ion)强度，每个通道一列。定量的原子事件因此不是"某蛋白在某细胞多少"，而是"某一次碎裂中 16 个通道各读到多少"。

通道与细胞不能画等号。64 个通道里，载体通道(carrier channel)装载约 200 个细胞当量，为低丰度肽段抬高峰形——SCoPE-MS 以来的标准配置（Budnik et al., 2018）；另有参考通道(reference channel)（约 5 个细胞当量）、空白通道(blank channel)与未用通道，其余才是单个细胞。哪一列是谁，全凭注释表交代：run、通道、SampleType 与制备批次各占一列（表 4.1-1）。图 4.1-1 把三层矩阵与通道构成画在一处。

图 4.1-1　定量矩阵的三层结构与通道构成。左侧为两次归并：1,362 行 PSM 按修饰后序列逐通道取中位数得到肽段层，再按 leading razor 蛋白逐通道取中位数得到蛋白层；右侧为一个 run 的 16 个 TMT 通道构成（示意，具体分配以注释表为准），4 个 run 共 64 个通道对应 sampleAnnotation 的 64 条记录。行数在两次跳变中递减、列数不变；分析用矩阵只保留单细胞通道作列（Specht et al., 2021；Gomoryova and Hecht, 2025；作者整理）。

4.1.2 第一层：肽段-谱图匹配

第一层矩阵以 PSM 为行、64 个通道的强度列为列。1.4 节从鉴定一侧定义过 PSM，定量一侧只须补一句：它离测量最近、未经任何归并修饰，上层矩阵的每一个数归根结底都是它的函数——定义见下框。

定义

肽段-谱图匹配（peptide-spectrum match, PSM，定量视角）：一次碎裂事件所产生的全部定量与鉴定信息的记录——肽段序列与修饰、蛋白归属等元数据，加上同 run 全部通道的报告离子强度。evidences.txt 的一行即一个 PSM；单细胞 TMT 流程的第一轮质控（q 值、PIF、SCR）都在这一层完成。

元数据列合起来是每个 PSM 的"可信度名片"。q 值承接目标-诱饵控制：教程剔除反向序列与污染库命中，要求蛋白层 q 值不超过 1%。母离子隔离纯度(precursor intensity fraction, PIF)是隔离窗口内归属目标母离子的信号占比——共洗脱肽段挤进窗口越多，PIF 越低，通道间比值被压缩扭曲得越重（见 1.4、2.5 节），PIF 低于 0.8 剔除。另设整 run 关卡：run 的 PSM 不足 150 视为进样失败，整体出局（Gomoryova and Hecht, 2025）。

质控放在 PSM 层，次序上有讲究：这层的任何缺陷都会向上传染，上层却看不出下层的问题；先在源头设卡、再逐级聚合，是标准化流程的共同纪律（Grégoire et al., 2024；Gatto et al., 2023）。

4.1.3 第一跳：从 PSM 到肽段

同一肽段在 evidence 表里常占多行，原因写在采集规则里：动态排除窗口过期后同一离子再次入选、相邻循环重复选中同一色谱峰、不同电荷态各自碎裂一次（1.4 节）。行数反映仪器调优与样品复杂度，而非肽段数目。归并规则：按修饰后序列分组，组内逐通道取中位数，得到肽段层的一行。

x̂_p,c = median{ x_i,c : PSM i 归于肽段 p，x_i,c ≠ NA }

(4.1-1)对肽段 p 的全部 PSM 在通道 c 上分别取中位数（教程参数 colMedians，缺失值不参与）。数值例：median(120, 100, 130) = 120。聚合逐通道独立进行——不同通道的强度绝不能混到一起平均，通道之间本来就有生物差异，混算等于提前把矩阵的列抹平一次。

方法

用中位数聚合的理由：抗离群。三个 PSM 的强度 {120, 100, 130}，中位数 120，均值 116.7，两者相近；可一次隔离污染足以制造 {120, 100, 130, 3,000} 这样的集合——中位数 125，几乎不动，均值 837.5，完全失真。单次碎裂的离群事件在 PSM 层并不罕见，中位数把"多数 PSM 的共识"与"单次事故"分开，事故被压制而不是被放大。代价是效率略低：中位数对分布中心的信息利用不如均值充分，但在离群风险面前，这份保守是值得的。

归并同时改写缺失结构：某通道只在三个 PSM 中的一个有值，中位数照常给出结果——肽段层缺失率低于 PSM 层；行内空洞被"至少测到过一次"填上，那一次的质量如何，聚合后不再可见（见警示框与 4.1.7）。

4.1.4 第二跳：从肽段到蛋白

蛋白层的行是蛋白，更准确地说是记账代号。归属采用 MaxQuant 的 leading razor 规则：特有肽段自然归其主；歧义肽段（序列同时出现在多种蛋白里）统一记给蛋白分组(protein group)内特有肽段最多的成员。1.4 节剖析过这种归属的先天含糊：分组内成员无法区分，共享肽段的信号是组内成员之和——蛋白层的"一个蛋白"，实质是"一组肽段选出的代言人"。

聚合统计量教程仍取中位数（按 Leading.razor.protein 分组、逐通道 colMedians）。求和保留总量信息，但蛋白的值随可用肽段数目涨落；中位数对肽段子集的增删稳健，更合差异丰度分析对跨样品一致性的要求（Gomoryova and Hecht, 2025；Grégoire et al., 2024）。

两跳走完，矩阵定格：行数从 1,362（PSM，教程子集）降到肽段、再降到蛋白，列数不变。参照 SCoPE2 全量数据：1,490 个细胞中定量 3,042 种蛋白（Specht et al., 2021）；教程子集过滤完毕、填补之前，蛋白矩阵仍有约 33% 缺失格——稀疏是常态，成因见 4.1.7。

警示

聚合会掩盖层内缺陷。蛋白值由几条肽段的中位数构成时，其中一条严重离群、或某通道整条蛋白只靠一条肽段撑着，蛋白层都看不出来；肽段值同理，遮住了 PSM 间的不一致与单 PSM 的低质量。质控若只做在蛋白层，等于把体检推迟到病灶扩散之后。规范的做法是逐层设卡：PSM 层查 q 值、PIF 与 SCR，肽段层查 CV 与缺失，蛋白层再查缺失与批次（4.6 节）——每一层的指标回答各自的问题，谁也不能替谁把关（Gatto et al., 2023）。

4.1.5 注释表：矩阵的坐标系

定量矩阵的行有蛋白名作坐标，列的坐标全在注释表：SampleType 把 64 个通道分成六类（表 4.1-1），凡按列身份操作的计算都要先问它。

表 4.1-1六类通道的装载与流程角色（Galaxy 教程数据）
SampleType	中文	装载内容	在流程中的角色
Carrier	载体	约 200 个细胞当量的混合材料	抬高峰形、提高鉴定率；SCR 的分母
Reference	参考	约 5 个细胞当量的混合材料	跨 run 对齐的公共参照（4.3、4.6 节）
Blank	空白	只走试剂与标记，无细胞	背景与残留污染的经验分布
Unused	未用	未标记或未上样	占位，不参与任何计算
Monocyte	单核细胞	单个 U-937 单核细胞	生物条件一，进入矩阵的列
Macrophage	巨噬样细胞	单个经 PMA 分化的细胞	生物条件二，进入矩阵的列

注释表在质控里反复出场：算 SCR 要找同 run 的载体列，算 MedianCV 要挑单细胞列并以空白列作参照，4.6 节的批次校正靠制备批次列。注释错一行，下游全错且错得沉默——把载体误标成细胞，SCR、列归一化与差异分析一起失真。矩阵的两维，一维写在序列里，一维写在这张表里，这也是 scp 框架把两者并列为必需输入的原因（Vanderaa and Gatto, scp 文档；Grégoire et al., 2024）。

习题 4.1-1

设某实验的 4 个 run 完全同构，每个 run 的 16 个通道分配为：1 载体、1 参考、1 空白、3 未用、10 个单细胞（4 个单核、6 个巨噬样）。（a）最终"细胞 × 蛋白"定量矩阵的列数是多少？其余通道去向何处？（b）空白通道不进矩阵，为什么要占用一个通道？（c）若把参考通道误标为单细胞，哪些计算最先失真？

参考解答

（a）列数为 4 × 10 = 40。载体作 SCR 的分母与峰形助推，用后即弃；空白用于估计背景；未用通道不参与计算——它们都不进入分析矩阵。（b）空白通道给出"没有细胞时的读数"，是背景、残留污染与仪器噪声的经验零分布；MedianCV 这类阈值也要靠空白通道的分布核对落点。（c）凡"按列身份挑集合"的计算全部中招：MeanSCR 的分子集合把参考通道计入、MedianCV 的细胞集合混入参考通道；参考通道装载约 5 个细胞当量，强度天然高出单细胞数倍，列归一化（除以列中位数）的尺度随之被拖偏，且这种偏差不报错、只 quietly 地改变数值。

4.1.6 三项质量控制指标

三层结构搭好后，问题是：哪些行、哪些列值得留下？三项指标各管一段——SCR 管单个 PSM 的定量是否反常，MedianCV 管整个通道是否自洽，缺失率管特征或通道还有多少观测可用（Gomoryova and Hecht, 2025）。

样品/载体比：单次定量的反常检测

样品/载体比(sample-to-carrier ratio, SCR)把每个单细胞通道的强度放到同 run 载体的标尺上：

SCR_i,c = I_i,c / I_i,C，　MeanSCR_i = mean_{c ∈ 单细胞通道} SCR_i,c

(4.1-2)I 为报告离子强度；C 为与通道 c 同一 run 的载体通道（约 200 细胞当量）。载体是同 run 全部通道的公共参照，SCR 因此是 run 内相对量，天然不吃 run 间仪器波动。数值例：载体 4,000、单细胞通道 320，则 SCR = 0.08。

定义

样品/载体比（sample-to-carrier ratio, SCR）：单细胞通道与同 run 载体通道的报告离子强度之比，逐 PSM、逐通道计算，再对 PSM 的全部单细胞通道取均值得 MeanSCR。载体约 200 个细胞当量，故期望值约 1/200 = 0.005；实测分布的峰在 0.01 附近。MeanSCR 高于 0.1 的 PSM 剔除——这把尺子量的是"高得反常"，不是"低得可怜"。

方向容易想反。单细胞信号弱是常态，SCR 低于期望并不出局——计数过少、比值全由噪声的隐患，由计数本身与 CV 判断；出局的是 SCR 异常偏高的 PSM：单细胞信号高到只比 200 个细胞当量的载体差十倍以内，多半是隔离窗口混入别家肽段、串扰或污染，"单细胞"通道的强度已不能归给这条肽段，错误会顺着两次聚合向上传导。教程把阈值放在分布长尾的根部 0.1（图 4.1-2 上）。

习题 4.1-2

某 PSM 的载体通道强度为 4,000，各单细胞通道强度的均值为 320，MeanSCR = 0.08。（a）按教程规则，该 PSM 保留还是剔除？（b）与期望值 0.005 相比，0.08 意味着什么？（c）阈值收到 0.05 与放到 0.2，各付出什么代价？

参考解答

（a）保留：0.08 低于 0.1，不在剔除之列。（b）0.08 高出期望约 16 倍，虽未越线，已落在分布右尾——这类 PSM 值得人工复查共洗脱情况与 PIF，并留意其报告离子的绝对计数是否支撑定量，而不是默认无事。（c）收到 0.05：更多可疑但尚可用的定量出局，矩阵更稀，偏向"干净"通道，数据量换可信度；放到 0.2：更多近污染的强度混进细胞列，向上聚合后形成系统性偏差，差异分析可能出现假信号。0.1 是"宁可缺、不可错"与数据量之间的折中——缺失尚可填补（4.4 节），错值会一路传导到蛋白层。

变异系数：通道自洽性的度量

变异系数(coefficient of variation, CV)是一组数值的标准差与均值之比：

CV = s / x̄

(4.1-3)s 为标准差，x̄ 为均值，无量纲。数值例：{100, 120, 80, 100, 100} 的均值 100、标准差约 14.1，CV ≈ 0.14。口径必须写明：教程在列归一化后的原始强度尺度上、于单个通道内按蛋白分组计算（组内至少 5 条有值肽段，nobs = 5），再跨蛋白取中位数得该通道的 MedianCV。若在 log2 尺度上工作，CV ≈ ln2 · σ(log2)；跨尺度、跨分组的 CV 不可直接比较。

教程的用法：对每个通道，把蛋白当分组，在同一细胞内对每个蛋白的肽段强度各算一个 CV，再跨蛋白取中位数，得到通道的 MedianCV。机理在化学计量——同一蛋白的肽段出自同一个母分子池，通道质量好时应给出彼此一致的相对丰度；上样不足、标记不匀、分离不稳的通道，这种内部一致性最先崩坏。MedianCV 因而是技术噪声的代理：一个数概括一个通道的自洽程度。教程剔除 MedianCV 大于 0.65 的通道，空白通道的分布给出"没有细胞时的分数"作参照（图 4.1-2 下）；在通道内而非细胞间计算，为的是只量通道、不量细胞——同型细胞间的真异质性不该算进技术噪声。

缺失率：稀疏性的直接度量

缺失率(missing rate)有两种视角。行视角：一个特征（肽段或蛋白）在多少比例的细胞中缺失，直接度量矩阵的稀疏性；教程剔除缺失超过 99% 的肽段——几乎全缺的行，任何填补都接近编造。列视角：一个细胞缺失多少特征，配合强度与 MedianCV 判断通道生死。两项互补：CV 高但观测齐全，可能是真实的细胞间差异；大面积缺失，更可能是技术事故。三项指标的门槛汇总见表 4.1-2。

表 4.1-2三项质控指标的作用层、算法与教程阈值
指标	作用层	怎么算	教程阈值	剔除的对象
SCR	PSM × 通道	单细胞通道强度 ÷ 同 run 载体通道强度，按 PSM 取均值	MeanSCR ≤ 0.1	信号高得反常的 PSM（疑似污染、串扰）
CV（MedianCV）	通道（细胞）	通道内、蛋白内肽段间算 CV，跨蛋白取中位数（≥5 条肽）	MedianCV ≤ 0.65	自洽性差的通道（上样、标记失败）
缺失率	特征 / 通道	行内（或列内）NA 所占比例	缺失 ≤ 99%	几乎全缺的肽段；列缺失率辅助判通道

图 4.1-2　两项质控指标的分布几何（示意）。上：MeanSCR 的期望值为 1/200 ≈ 0.005（虚线），实测分布峰约 0.01，教程剔除右侧长尾——阈值 0.1 以上的 PSM 信号高得反常，多为隔离窗口混入他肽、串扰或污染。下：每个通道一个 MedianCV（通道内、蛋白内肽段间 CV 的中位数），阈值 0.65 右侧的通道自洽性差，判为坏通道；空白通道的分布提供"无细胞时的分数"作参照（Gomoryova and Hecht, 2025；作者整理）。

习题 4.1-3

某肽段在同一 run 的 4 个单核细胞通道上有 3 个 PSM，强度如下（NA 为缺失）：

表 4.1-3习题 4.1-3 的 PSM 强度（任意单位）
PSM	通道 c1	通道 c2	通道 c3	通道 c4
PSM 1	120	90	140	NA
PSM 2	100	110	60	80
PSM 3	130	NA	80	100

（a）按式 (4.1-1) 完成逐通道中位数聚合。（b）计算该肽段在 4 个通道间的 CV（同型细胞间口径，样本标准差）。（c）若这 4 个值改由同一蛋白的 4 条肽段在同一通道上读出，按教程口径这个 CV 用在何处？（d）通道 c2 只有 2 个 PSM 有值，聚合结果的可靠性如何？

参考解答

（a）c1：median(120, 100, 130) = 120；c2：median(90, 110) = 100；c3：median(140, 60, 80) = 80；c4：median(80, 100) = 90。（b）四个通道值 {120, 100, 80, 90}：均值 97.5；离差 22.5、2.5、−17.5、−7.5，平方和 875，样本方差 875/3 ≈ 291.7，标准差 ≈ 17.1，CV ≈ 17.1/97.5 ≈ 0.18。（c）这是"通道内、蛋白内肽段间"口径的 CV：逐蛋白算出后跨蛋白取中位数，构成该通道的 MedianCV，与 0.65 对照。注意教程要求组内至少 5 条有值肽段（nobs = 5），4 条仅够示意方法。（d）两个观测的中位数即两值之均 100：完全失去"多数共识"的稳健性——中位数聚合的抗离群能力来自多个 PSM 的相互制衡，观测太少，制衡无从谈起。这正是各流程普遍设置最小观测数的原因。

4.1.7 双重稀疏：缺失是生成过程的属性

缺失写在两个位置。一类在"格"里：肽段级缺失——某细胞 × 某条肽段无值，成因在采集一侧：DDA 未选中（1.4 节的随机成分）或信号低于检出限，丰度越低越易缺。另一类在"列"里：通道级缺失——整列低信号或大面积无值，成因在制备一侧：上样、标记失败或细胞丢失。SCR 与 MedianCV 抓后者，前者靠缺失率刻画。

缺失不是可以一扔了之的噪声，而是生成过程的属性：一个格是否缺失，携带哪个 run、哪种通道、多低丰度的信息，且缺失概率与真值相关——低丰度肽段系统性地更易缺。当作随机噪声删除，或一律当零，都会把"测不到"错译成"不存在"；填补及其前提留待 4.4 节。

还有一层容易误读：聚合让表观稀疏度逐层下降——每跳一次，行内只要剩下一个观测就有值。蛋白层热图看上去比 PSM 层"完整"，部分只是归并的副产品，不是测量变好的证据。读单细胞蛋白矩阵，应先问一句：这层值之下垫着几条肽段、几个 PSM、过了哪几道卡。

本节建立了全章的数据观，三条线索收拢如下：

结构：一次实验 = 多个 run × 16 通道；三层矩阵（PSM、肽段、蛋白）经两次逐通道中位数归并而成，行数递减、列数不变、缺失率逐层下降；
坐标：注释表把通道映射到载体、参考、空白、未用与单细胞，是一切按列操作的总开关；
判据：SCR 查单次定量的反常（高于 0.1 剔除），MedianCV 查通道自洽性（高于 0.65 剔除），缺失率查特征与通道的可用性（高于 99% 剔除）；缺失是采集与制备的内生属性，双重稀疏由此而来。

4.2 节起，这套结构将在 Bioconductor 的 scp 包与 QFeatures 框架里落地为代码对象；此后的归一化、填补与批次校正，全部踩在本节铺定的三层坐标之上。

关键术语

采集（run）(run): 一次进样上柱的完整 LC-MS/MS 分析，仪器时间与批次的原子单位。
通道（channel）(channel): 一个 TMT 标记位及其对应的报告离子强度列，每个 run 16 个。
肽段-谱图匹配 (peptide-spectrum match): 一次碎裂事件的鉴定元数据与全通道定量强度的合体，矩阵第一层的行。
母离子隔离纯度 (precursor intensity fraction): 隔离窗口内归属目标母离子的信号占比，共洗脱污染的量度。
注释表 (sample annotation): 把通道映射到样品类型与批次的坐标表，一切按列操作的总开关。
样品/载体比 (sample-to-carrier ratio): 单细胞通道与同 run 载体通道的报告离子强度之比，期望约 1/200。
变异系数 (coefficient of variation): 标准差与均值之比；教程口径为通道内、蛋白内肽段间的中位 CV。
中位变异系数 (MedianCV): 每通道一个的自洽性分：蛋白内肽段间 CV 跨蛋白取中位数。
缺失率 (missing rate): 一行（特征）或一列（通道）中缺失值所占的比例。
leading razor 蛋白 (leading razor protein): 歧义肽段记账规则下的主归属蛋白，蛋白层行的名字。
蛋白分组 (protein group): 共享肽段无法彼此区分的一组蛋白。

参考文献与延伸阅读

Gomoryova K, Hecht H. 2025. Single Cell Proteomics data analysis with bioconductor-scp. Galaxy Training, training.galaxyproject.org（2025-02-07 发布）.
Grégoire S, Vanderaa C, Gatto L. 2024. Standardized workflow for mass-spectrometry-based single-cell proteomics data processing and analysis using the scp package. Methods in Molecular Biology 2817: 177–.
Vanderaa C, Gatto L. scp: analysis of single-cell proteomics data. Bioconductor 包及文档, uclouvain-cbio.github.io/scp/.
Specht H, Emmott E, Petelski AA, Huffman RG, Perlman DH, Koller A, Slavov N. 2021. Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2. Genome Biology 22: 50.
Gatto L, Aebersold R, Slavov N, et al. 2023. Initial recommendations for performing, benchmarking and reporting single-cell proteomics experiments. Nature Methods 20: 375–386.
Budnik B, Levy E, Harmange G, Slavov N. 2018. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology 19: 161.