单细胞蛋白组学导论SINGLE-CELL PROTEOMICS · MASS SPECTROMETRY & AFFINITY METHODS
第5章 · 5.1

5.1 从矩阵到生物学：降维、聚类与差异丰度

From Matrix to Biology: Dimensionality Reduction, Clustering and Differential Abundance
摘要　定量矩阵就绪之后，生物学要从统计里挣出来。本节依次讨论三件事：主成分分析如何兼任质控与去噪，而 UMAP 只承担呈现；高缺失矩阵上聚类对距离定义与填补口径的依赖；差异丰度检验如何以线性模型吸收批次、以供体为单位避开伪重复、以 BH 程序控制错误发现率。效应量先于 p 值、参数随文报告，是从矩阵通向生物学的两条纪律。

5.1.1 降维的双重角色：质控、去噪与呈现

4.3 节收尾的那张矩阵——行是蛋白、列是细胞、无缺失、批次已校正——是下游一切分析的起点。降维在这张矩阵上承担两份工作。第一份是质控：4.6 节已把主成分分析(principal component analysis, PCA)用作诊断图，检查批次与条件沿前两个成分的分布——各批自成一群，说明矩阵中最大的方差仍被技术差异占据，任何下游结论都要先打回重审。第二份是去噪：上千维的蛋白空间里，相当一部分维度由测量噪声主导；把细胞投影到前若干个主成分张成的低维空间，等于只保留方差最大的方向、丢弃噪声占优的方向。下游的聚类与检验都在这个成分空间里进行，而不是在原始蛋白空间里。

PCA 的数学内核一句话讲完：对列中心化后的定量矩阵作协方差矩阵特征分解（式 5.1-1），特征向量给出各主成分的方向，特征值给出该方向上的方差；第一主成分即一切单位线性投影中方差最大的方向。把各成分的方差占比 λk/Σλj 排成碎石图(scree plot)，曲线由陡转缓的"肘部"就是信号与噪声的大致分界。

Σ wk = λk wk，　λ1 ≥ λ2 ≥ … ≥ 0
(5.1-1)Σ 为列中心化定量矩阵的协方差矩阵。特征向量 wk 即第 k 主成分的方向，特征值 λk 为该方向上的方差；w1 是所有单位线性投影中方差最大的方向——PCA 的全部几何就压在这一句特征分解里。

单细胞蛋白组矩阵的形状与转录组相差悬殊：SCoPE2 的全量数据为 3,042 种蛋白 × 1,490 个细胞，而单个细胞通常只定量到约千种蛋白（Specht et al., 2021）——维度上千、缺失过半。转录组流程习惯取 10–50 个主成分起步；蛋白数据的细胞数常以百计，肘部往往更靠前。成分数没有唯一正确值，与后续每一步的选择一样，错不在取多取少，而在不报告、不做敏感性检验。

UMAP 与 t-SNE 的位置要摆正。二者为可视化而设计：保留局部邻近关系，压缩全局结构，图上两个点团的间距没有距离语义；参数一换（近邻数、最小距离、困惑度），整张图随之处变形。因此它们只承担呈现——把已经在成分空间里得出的聚类结果画给人看。在 UMAP 图上量距离、比较簇间远近、把图上"看得出"的差别当作统计结论，都是把图示误作数据。图 5.1-1 把四个环节的分工画在一起。

从矩阵到结论：PCA 兼任质控与去噪，聚类在成分空间进行，UMAP 只作呈现 从矩阵到结论：四个环节的分工 ① 蛋白矩阵（高缺失） ② PCA：质控＋去噪 ③ 聚类（成分空间） ④ UMAP（仅呈现） 行＝蛋白，列＝细胞 空白格＝缺失 PCA PC1 PC2 碎石图（肘部） 单核样 巨噬样 按条件/批次着色 k 个成分 切割高度 ≈ 分辨率 树状图：合并顺序与距离可读 仅呈现 UMAP 1 UMAP 2 高缺失：距离只在共享 观测上可比；填补口径 决定邻近关系（见 4.4） 质控：条件/批次沿成分 分布（4.6 的用法）；去 噪：只保留前 k 个成分 结论在此产生：聚类用 主成分空间；分辨率或 切割高度须随文报告 仅呈现：簇间距离无统 计语义；换参数即变形， 不参与任何检验 统计链条：矩阵 → 主成分 → 聚类与检验（结论产生于此） 链条之外：只作呈现 参数随文交代：填补、成分数 k、距离、分辨率/切割高度、模型、FDR 阈值（见 5.1.7）
图 5.1-1　从矩阵到结论的四个环节及其分工。①蛋白矩阵行是蛋白、列是细胞，空白格示意缺失——距离计算必须与缺失处理口径一致；②PCA 以条件/批次着色图承担质控（4.6 的用法），以碎石图肘部确定保留的成分数 k，把细胞送入低维信号空间；③聚类（图为层次聚类的树状图，图聚类同理）在主成分空间而非原始蛋白空间进行；④UMAP 只承担呈现，其距离不承载统计结论。统计结论产生于②③，④在结论链条之外。

5.1.2 距离与缺失：聚类前的纪律

聚类把"哪些细胞相似"交给计算，而相似必须先有定义。欧氏距离逐维求差，两个细胞之间的距离只在这两者都有观测的蛋白上携带信息：A 与 B 共享四百种蛋白、A 与 C 共享九百种，所谓"A 与 B 更近"就同时取决于数据与缺失的分布。4.4 节的填补口径在这里兑现——填补为下游计算提供一张完整矩阵，它是一种约定而非真值的恢复；换一种填补（kNN 的 k、填补与否、按行按列），距离随之改变，簇也随之处变。所以聚类之前必须保证距离定义与缺失处理一致：用什么填补、在哪个空间（原始蛋白还是主成分）上算距离，二者一并选定、一并报告；对填补方式做一次敏感性检验，看簇是否稳定，是廉价的保险。

算法有两族。图聚类(graph-based clustering)先把细胞连成 k 近邻图，再按模块度搜索社群划分；Leiden 算法修正了 Louvain 可能给出内部不连通社群的缺陷，保证划分中的每个社群连通（Traag et al., 2019）；分辨率(resolution)参数控制划分粒度，调高一档，一簇拆作两簇。转录组动辄数万细胞的规模正是图聚类的主场。层次聚类(hierarchical clustering)自底向上逐层合并，产出一棵树状图，切割高度即簇数；蛋白数据的细胞量常以百计，层次聚类往往已经够用，且树状图把合并顺序与合并距离一并呈现——哪个分支先分、分得多远，一目了然。两族之间没有高下，只有与数据规模、缺失结构的匹配；图聚类所依赖的 k 近邻图同样建立在距离之上，躲不开上一段的纪律。

无论哪一族，聚类结果都要回到 4.6 的诊断图上着色对照：簇是否对应设计中的条件、是否沿批次分布。聚类给出的是分组假说，成立与否仍要靠差异检验与外部证据来回答。

5.1.3 差异丰度：建模而非先校正再检验

术语先立规矩：蛋白层面的比较称差异丰度(differential abundance)检验，不称"差异表达"——测量对象是蛋白丰度，"表达"留在 RNA 层面。

定义

差异丰度：在两个及以上细胞群（或条件）之间，检验某一蛋白的相对量是否存在差异。检验以蛋白为单位逐一进行，比较的对象是细胞群而非单个细胞；结论的形式是"该蛋白在巨噬样细胞中相对单核样细胞上调（log2 倍数变化，校正后 q 值）"——效应量与校正后显著性必须同时给出。

检验手段从简到繁。两群比较可用 t 检验或 Wilcoxon 秩和检验，前提是观测彼此独立——这个前提在单细胞数据上恰恰最常塌方（下一小节专述）。条件与批次并存时，正规做法是线性模型（式 5.1-2）：条件与批次同时写进设计矩阵(design matrix)，批次作协变量(covariate)，逐蛋白拟合一次，检验条件系数。这正是 scplainer 的路线——建模而非先校正再检验：两段式流程把批次校正的估计误差固化进数据，后续检验无从知道这些值已经被改动；一体建模让批次的不确定性与条件的假设检验共享同一套方差框架（Vanderaa and Gatto, 2025）。4.6 节的警告在此同样成立：混杂的设计在模型里一样不可识别，只是报错更早、更明确（Grégoire et al., 2024）。

ypj = β0 + β1 xj + β2 bj + εpj，　H0: β1 = 0
(5.1-2)ypj 为蛋白 p 在细胞 j 的 log2 相对量；xj 为条件指示（如巨噬样 = 1、单核样 = 0），bj 为批次指示。感兴趣的量是 β1（条件效应），批次 β2 与之一同进入模型、一同估计——校正与检验在同一个模型内完成，而非先校正再检验。
习题 5.1-1

6 个细胞的两群比较，条件与批次如下：c1 对照/批次A，c2 处理/批次A，c3 对照/批次B，c4 处理/批次B，c5 处理/批次A，c6 对照/批次B。（a）按式 (5.1-2) 写出 6×3 设计矩阵（截距、处理、批次B）。（b）说明此设计中 β1 为何可识别。（c）若全部处理细胞都在批次A，矩阵会发生什么？

参考解答

（a）行按 c1–c6 依次为 (1,0,0)、(1,1,0)、(1,0,1)、(1,1,1)、(1,1,0)、(1,0,1)。（b）两个条件都同时出现在两种批次里（对照见于 A、B，处理也见于 A、B），处理列与批次列、截距列线性无关，设计矩阵列满秩，β1 有唯一估计——这正是 4.6 节"平衡设计"的矩阵表述。（c）处理列变为 (0,1,0,0,1,0)，且凡处理为 1 处批次B 必为 0，处理列可由截距与批次列线性表出，矩阵列亏秩，β1 与批次效应不可分解——条件与批次完全混杂，模型无解，这就是 4.6 说的"不可识别"。

5.1.4 两个陷阱：伪重复与多重检验

单细胞数据有两个专属的坑。第一个是伪重复(pseudoreplication)。

警示

伪重复：细胞不等于生物学重复。同一供体（或同一培养批、同一次制备）的细胞共享从取材到上机的全部技术史，生物学上也同源；把它们当作独立观测喂给 t 检验或 Wilcoxon，标准误遭系统性低估，p 值要多小有多小。Squair 等（2021）在转录组数据上的系统评测显示：细胞级检验在供体间真实无差异的设置下仍大量报出"显著"，错误发现率完全失控；把重复的单位换回供体，校准立即恢复。

出路有两条。其一是供体层面聚合，即伪体(pseudobulk)检验；其二是把供体作为区组因子写进线性模型（固定效应或混合模型），检验仍在蛋白层进行，但方差按供体结构估计。两条路的统计单位都回到供体，样本量从此是供体数而非细胞数——通量约 200 个细胞/24 h（SCoPE2 口径）意味着供体数常常吃紧，三五个供体已在下限附近，更少时只能描述、不能断言；这个瓶颈要在实验设计阶段就当作功效问题来规划（Gatto et al., 2023）。

方法

伪体检验的思路。把同一供体内属于同一细胞群的细胞聚合成一条"伪体"谱——每个蛋白取群内均值（或求和）——然后对伪体谱做常规两群检验（t、Wilcoxon 或负二项类模型）。重复的单位由细胞换回供体，伪重复随之消失；代价是功效受供体数硬性限制。单细胞蛋白组里"供体即实验单元"的设计，与 4.6 的批次设计同源：正交、平衡、每批都含每种条件。

第二个坑是多重检验(multiple testing)。一次分析对上千种蛋白各做一次检验，即便原假设全部为真，p < 0.05 仍会凭运气出现约 5%——1,000 次检验就是约 50 个假阳性，比任何真实的信号列表都长。对策是把标准从"单次检验犯错概率"换成错误发现率(false discovery rate, FDR)：拒绝集合中假阳性的期望比例。BH 步进程序给出它的经典控制（式 5.1-3；Benjamini and Hochberg, 1995）。

i* = max{ i : p(i) ≤ (i/m)·q }，拒绝 p(1), …, p(i*)
(5.1-3)m 个 p 值升序排列为 p(1) ≤ … ≤ p(m)，q 为预设的错误发现率水平（常取 0.05）。BH 是步进程序：从大秩往小秩找第一个满足临界规则的秩，其以下的全部拒绝；它控制的是拒绝集合中假阳性的期望比例，而非单次检验的第一类错误。

数值例：m = 5 个 p 值升序为 0.001、0.012、0.026、0.041、0.35，q = 0.05 时临界值为 0.010、0.020、0.030、0.040、0.050。逐秩比较：前三秩全部通过（0.026 ≤ 0.030），第四秩 0.041 > 0.040 落选；i* = 3，拒绝最小的三个。0.041 单独看过得了 0.05 这一关，放进族里比较后出局——多重校正的含义正在于此：一个 p 值的生死取决于它所在的集合。

习题 5.1-2

对 10 种蛋白做差异丰度检验，p 值升序为 0.001、0.004、0.012、0.018、0.028、0.031、0.09、0.15、0.42、0.77。取 q = 0.05，手工执行 BH：写出各秩的临界值，确定拒绝集，并说明 0.028 与 0.031 的结局。

参考解答

临界值 (i/10)×0.05 依次为 0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050。逐秩比较：i = 1–4 通过（0.018 ≤ 0.020），i = 5 失败（0.028 > 0.025），i = 6 也失败（0.031 > 0.030），其后均失败；i* = 4，拒绝 p 值最小的四个（0.001–0.018）。0.028 与 0.031 单独看都小于 0.05，BH 校正后双双落选——它们所在的位置不足以支撑"拒绝集合中假阳性不超过 5%"的承诺。这正是 5.1.5 强调效应量优先的又一理由：贴着显著性线的 p 值，命运随集合而变。

5.1.5 效应量优先于 p 值

p 值只回答"数据与无差异模型有多不兼容"，不回答差异有多大；而生物学住在后者里。单细胞蛋白组的 p 值尤其廉价：细胞数一多、伪重复未除，它想多小有多小。效应量(effect size)——log2 倍数变化及其区间——才载着生物学内容。火山图(volcano plot)把两者拼成一面：横轴效应量、纵轴 −log10 p，每蛋白一点（图 5.1-2）。右上与左上深处是既显著又方向明确的候选；贴着零线却窜得很高的"高瘦"点，显著而效应可疑，恰是伪重复与比值压缩最爱的形状。

火山图：效应量与显著性各占一轴，比值压缩把真差异拉向零点 火山图：效应量与显著性各占一轴（示意数据） −2 −1 0 +1 +2 0 2 4 6 8 10 log2 倍数变化（效应量） −log10 p（显著性） p = 0.05 −0.58 +0.58 下调且显著 上调且显著 比值压缩把真差异拉向 0 P1 可信上调 P2：p 极小、效应量可疑 P3：效应量大、证据弱 P4：无差异 虚线：横为 p = 0.05；竖为 |log2FC| = 0.58（倍数变化 1.5，经验效应量门槛）
图 5.1-2　火山图的两个轴与读法（示意数据）。横轴为 log2 倍数变化（效应量），纵轴为 −log10 p（显著性）；虚线分别标出 p = 0.05 与 |log2FC| = log2(1.5) ≈ 0.58 的经验效应量门槛。P1 效应量与显著性俱足，是可信的上调候选；P2 显著性极高而倍数变化仅约 1.1 倍，多半是伪重复或比值压缩的产物；P3 效应量大而证据不足，只能作提示；P4 无差异。曲线箭头示意比值压缩：观测到的倍数变化系统性小于真实值，越靠近外侧的点被拉得越多。

单细胞蛋白组的可信效应量门槛比转录组高。原因有二：多重标记定量受比值压缩(ratio compression)之累——共分离肽段的报告离子混入通道，把真实比值拉向 1（机理见 4.5）；单细胞测量噪声又进一步稀释组间差。两头夹击之下，到手的倍数变化已系统性小于真实值。经验之谈：倍数变化不足 1.5（|log2FC| < 0.58）的"显著"结果应当打上问号，除非供体层面的证据独立支持它；效应量报告区间而不只报点估计，区间跨过门槛的结果降级为"提示"而非"发现"。

习题 5.1-3

四个蛋白的检验结果为（log2 倍数变化，p 值）：P1（+1.8，2×10−7）、P2（+0.15，1×10−9）、P3（−1.6，0.04）、P4（−0.1，0.4）。在火山图上标出四点位置，逐个判断可信度，并说明各自的处置。

参考解答

P1 位于右上深处（倍数变化约 3.5 倍、显著性极高）：效应量与证据俱足，列为候选发现，再以供体级检验复核。P2 贴着零线窜到最高处（倍数变化约 1.11 倍）：典型的"高瘦"点——p 值小到反常而效应量微弱，伪重复或比值压缩即可造出这种形状，直接质疑，退回供体层面重检。P3 在左上边缘（约降至三分之一、p = 0.04 刚过线）：效应量大而证据不足，只作提示，增加供体或细胞数后再判。P4 在底部中央：无差异，不出现在任何名单里。一般规则：先看横轴够不够远，再看纵轴够不够高；只满足后者的，先怀疑检验单位。

5.1.6 案例：SCoPE2 的跨模态一致与分歧

案例

SCoPE2 的跨模态一致性。Specht 等（2021）以 SCoPE2 在 10 天机时内定量 1,490 个单核/巨噬样细胞（U-937 经 PMA 分化）的 3,042 种蛋白；聚类把细胞分为单核样与巨噬样两群，两群间的差异蛋白与同一体系并行的单细胞转录组在方向上一致——在"细胞状态"这个层面，蛋白与 RNA 互相印证，差异丰度结论由此获得独立模态的外部证据。

一致是方向性的，不是逐点的。mRNA 与蛋白丰度的跨基因相关只在 0.4–0.6 之间，mRNA 单独约解释四成蛋白变异（1.1 的口径）；翻译调控、蛋白半衰期与两侧的测量噪声都让两条模态各说各话。这条鸿沟在下游显形为具体的分歧：RNA 上显著的基因，蛋白未必跟随；蛋白层显著的表面分子，其转录本可能纹丝不动。分歧不裁决谁对谁错——两层测量各有独立信息；报告跨模态比较时须写清口径：哪个细胞群、哪一层、何种检验、何种阈值。

对差异丰度分析而言，跨模态一致性是一种外部证据：蛋白差异与 RNA 差异同向，伪重复与技术伪影的嫌疑就小得多；只有蛋白层独有、RNA 层沉默的差异，才需要更谨慎的供体级验证——它要么是噪声，要么正是蛋白测量独有的发现，两种命运都值得多花一步。

5.1.7 可重复的报告

本节的每一步都带自由度：填补方法、主成分数、距离定义、聚类算法与分辨率（或切割高度）、检验模型与协变量、供体聚合方式、FDR 阈值、效应量门槛。社区白皮书把它们全部列为报告义务——参数随文交代，关键参数上下拨动一档，看结论是否稳定（Gatto et al., 2023）。一条不报告参数的分析，等于把结论建立在不为人知的自由度上；把降维参数、聚类分辨率、检验模型与 FDR 阈值写进正文，结论才可复查、可否定（Grégoire et al., 2024；Gomoryova and Hecht, 2025）。

这些选择孰优孰劣，不能靠各说各话，要靠系统评测。这正是本章往后的议题：DIA 信息学流程如何横评（5.2），数据处理流程如何在数千种组合中导航（5.3），批次与缺失能否并入统一嵌入（5.4），掺入、稀释与重复如何充当评估的试金石（5.5）。

矩阵既成，本节把从矩阵到结论的下游纪律整理为三条：

  • 降维分工：PCA 兼任质控与去噪，成分数由碎石图肘部确定并随文报告；UMAP/t-SNE 只作呈现，其距离不承载统计结论；
  • 距离与缺失一致：填补口径决定邻近关系，聚类（蛋白数据上层次聚类常够用，规模大时用图聚类）在主成分空间进行，结果回到诊断图着色对照；
  • 差异丰度：批次写进设计矩阵——建模而非先校正再检验；供体为统计单位以防伪重复；BH 步进控制错误发现率；效应量优先于 p 值，可信倍数变化门槛高于转录组。

下游的纪律立住之后，问题转向方法本身：这些工具与流程组合孰优孰劣，需要基准评测来回答（5.2）。

关键术语

主成分分析 (principal component analysis, PCA)
协方差矩阵特征分解给出的正交投影，既作质控图也作去噪前置。
碎石图 (scree plot)
各主成分方差占比按序排列的条形图，肘部提示保留的成分数。
图聚类 (graph-based clustering)
在 k 近邻图上按模块度搜索社群的聚类族，Leiden 为代表算法。
分辨率 (resolution)
图聚类的粒度参数，调高则社群更小更多。
层次聚类 (hierarchical clustering)
逐层合并细胞并输出树状图，切割高度决定簇数。
差异丰度 (differential abundance)
细胞群之间蛋白相对量的比较与检验；蛋白层面不称"差异表达"。
伪重复 (pseudoreplication)
把不独立的观测（同一供体的细胞）当作独立重复所犯的推断错误。
伪体 (pseudobulk)
把同一供体内的细胞聚合成一条谱，使检验单位回到供体。
错误发现率 (false discovery rate, FDR)
拒绝集合中假阳性的期望比例，由 BH 步进程序控制。
效应量 (effect size)
差异的大小，如 log2 倍数变化及其区间；优先于 p 值报告。
火山图 (volcano plot)
横轴效应量、纵轴 −log10 p 的散点图，一次呈现全体检验结果。
比值压缩 (ratio compression)
共分离信号混入使多重标记比值向 1 收缩，效应量被低估。

参考文献与延伸阅读

  1. Specht H, Emmott E, Petelski AA, Huffman RG, Perlman DH, Koller A, Slavov N. 2021. Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2. Genome Biology 22: 50.
  2. Vanderaa C, Gatto L. 2025. scplainer: using linear models to understand mass spectrometry-based single-cell proteomics data. Genome Biology 26: 237.
  3. Grégoire S, Vanderaa C, Gatto L. 2024. Standardized workflow for mass-spectrometry-based single-cell proteomics data processing and analysis using the scp package. Methods in Molecular Biology 2817: 177–.
  4. Squair JW, Gautier M, Kathe C, Anderson MA, James ND, et al. 2021. Confronting false discoveries in single-cell differential expression. Nature Communications 12: 5692.
  5. Benjamini Y, Hochberg Y. 1995. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B 57: 289–300.
  6. Traag VA, Waltman L, van Eck NJ. 2019. From Louvain to Leiden: guaranteeing well-connected communities. Scientific Reports 9: 5233.
  7. Gatto L, Aebersold R, Slavov N, et al. 2023. Initial recommendations for performing, benchmarking and reporting single-cell proteomics experiments. Nature Methods 20: 375–386.
  8. Gomoryova K, Hecht H. 2025. Single cell proteomics data analysis with bioconductor-scp. Galaxy Training, training.galaxyproject.org.
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