5.6.1 样品数量与细胞异质性
临床样品可能同时受到数量和异质性的限制。细针穿刺(fine-needle aspiration, FNA)获得的可用细胞数取决于病灶、取样与处理，研究方案有时只能分配数以千计的细胞。循环肿瘤细胞(circulating tumour cell, CTC)则更稀少：一项头颈鳞癌可行性队列检出 2–24 个/ml（Payne et al., 2023），这一范围不能代表所有癌种或患者。肿瘤亚克隆、浸润免疫细胞和基质细胞的状态差异还会影响测量。整体测量(bulk measurement)可分析总体变化，却难以单独确定低频亚群的组成与状态；是否需要单细胞分辨率，取决于目标亚群和研究问题。
单细胞质谱已证明可从约 100–200 pg 蛋白的细胞中获得广泛的蛋白信息，但深度依赖细胞类型与流程。Ye 等（2025）的 Chip-Tip 研究在 HeLa 培养细胞、Orbitrap Astral 窄窗口 DIA 的 4Th6ms 设置下，获得单细胞蛋白鉴定中位数 5,204，某次单细胞制备超过 6,000；相关单细胞分析涵盖 168 种激酶与 200 余种质膜蛋白。“覆盖约半数表达蛋白”是对此类深度研究的概括（Sinn and Demichev, 2025），不是患者稀有细胞的通用覆盖率。目标蛋白能否稳定检出、定量是否准确，仍需在相应临床基质中验证。
蛋白测量还可直接研究药物相关分子的状态。激酶抑制剂作用于蛋白，抗体药识别特定表位，但用药依据可以来自蛋白、核酸或其他经过验证的指标。伴随诊断(companion diagnostic)为特定药物的安全有效使用提供必要信息：HER2 的免疫组化检测反映蛋白表达，而 HER2 基因扩增通常由原位杂交等核酸方法检测，两者不能混写；PD-L1 也有相应免疫组化检测。测量层级与生物学机制相关，并不自动使其具有临床决策效力，还需针对具体药物和适用人群验证（FDA；Guo et al., 2025）。
5.6.2 三类应用及其证据范围
方向一：肿瘤微环境的细胞状态解析。肿瘤微环境(tumour microenvironment, TME)研究需要同时区分细胞类型与功能状态。CD8 阳性 T 细胞可表现出效应、记忆或T 细胞耗竭(T cell exhaustion)相关特征；PD-1、TIM-3、LAG-3 等免疫检查点(immune checkpoint)分子可提供状态信息，但单一标志阳性不足以判定耗竭。质谱流式细胞术(cytometry by time-of-flight, CyTOF)通过金属同位素抗体一次测量数十个参数，适合联合表型分析；其单细胞信号测量基础见 Bendall et al.（2011）。非靶向单细胞质谱可探索面板之外的蛋白，但仍受提取、离子化、丰度和检索策略的选择性影响，不应称为完全无偏测量。
循环肿瘤细胞的液体活检研究。Payne 等（2023）在 14 例初治头颈鳞癌患者中检验液体活检(liquid biopsy)的单细胞表型路线：Transfix 采血固定，采用此前验证的约 72 h 表型保存窗口，经 Parsortix 按大小与可变形性富集，再用 41 种抗体进行质谱流式测量。13/14 例检出 CTC，浓度 2–24 个/ml，合计 1,150 个；聚类区分出上皮、早期及晚期上皮-间充质转化(epithelial–mesenchymal transition, EMT)相关群体，pCREB、pERK 等信号在群间存在差异。与该研究的混合 CTC RNA 测序相比，质谱流式识别了其中 5 例未被 RNA 方法识别的低频 EMT 群体。队列规模小且偏向晚期疾病，结果支持方法可行性与候选表型发现，尚未证明治疗分层的临床效用；也不能据此比较所有单细胞蛋白与 RNA 方法。
方向二：稀有细胞的深蛋白组。CTC 与穿刺样品可用于探索细胞间的广泛蛋白差异，但必须先检验回收与测量性能。HeLa 细胞中超过 6,000 种蛋白的结果来自特定培养、制备和采集设置（Ye et al., 2025）；患者细胞的大小、状态、固定方式及背景不同，不能直接沿用该数字估算深度。可行性研究应先报告成功分析的患者比例、目标细胞回收率、目标蛋白检出率及定量误差，再评估扩大队列的条件（Guo et al., 2025）。
方向三：药物扰动下的信号通路动态。磷酸化特异性抗体可检测刺激或给药后的特定信号状态。Bendall 等（2011）在人类造血细胞的刺激与药物处理实验中一次测量 34 个参数，为此类分析提供了示范；这并不直接证明任何患者给药前后方案的效果。临床配对取样还需控制采样时间、细胞组成和样品处理。非靶向质谱也已在培养细胞中检出部分修饰位点，但修饰肽段丰度、位点定位与定量完整性仍有限，总蛋白数不能替代修饰层面的性能指标（Ye et al., 2025；Slavov, 2026）。
习题 5.6-1
某研究拟以单细胞质谱分析实体瘤患者的 CTC。教学设定：CTC 浓度约 5 个/ml，富集至可测样品的平均回收率约 50%；暂按 200 个细胞/24 h 估算通量，该数值参考 SCoPE2 单核/巨噬细胞研究，并非已验证的 CTC 通量（Specht et al., 2021）。（a）若每位患者希望获得 20 个 CTC，按期望值应采血多少毫升？单次上限为 10 ml 时，对低浓度患者有何限制？（b）50 例患者各分析 20 个细胞，理想采集需多少机时？（c）若改用 41 参数质谱流式，采集速率为数百事件/秒，能否仅凭 CTC 数量确定实际耗时？
参考解答（a）全血中所需的期望 CTC 数为 20/0.5 = 40，对应 40/5 = 8 ml，低于 10 ml 上限；但这是期望值，不保证实际获得 20 个。若浓度为 2 个/ml，则期望所需体积为 20 ml，超过设定上限。方案应估计达标概率，并预先规定收获不足时的处理。（b）50 × 20 = 1,000 个细胞；按假定通量需约 5 天连续机时，实际还应计入质控、样品装载和重跑。（c）仅计算 1,000 个目标事件所需的采集时间很短，但真实样品还含大量非目标事件，并有富集、染色、清洗与质控耗时。总耗时可能为数分钟至数小时甚至更长，须知道总事件数与处理安排后才能估算，不能认定采集已不再限制通量。
5.6.3 临床转化需要验证的四个方面
这些案例主要支持研究测量与候选标志物探索。若要形成临床检测，需要分别验证样品、运行流程、跨中心可比性和结果解释，四方面可并行推进（图 5.6-2）。
第一，样品与固定。福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE)是常见病理保存方式，交联会改变蛋白提取与酶解条件。血液从采集到处理的间隔也可能影响状态；Payne 等所用固定与富集组合具有约 72 h 的既有验证窗口（Payne et al., 2023），不意味着任何标志物和检测方式都在该时间内稳定。nPOP 等悬液细胞协议不能未经验证就移用于 FFPE，但针对 FFPE 的空间微切割与蛋白提取方法已在发展（Leduc et al., 2024；Dong et al., 2026）。
FFPE 需要专门的处理与取样验证。甲醛可与蛋白上的亲核基团反应，形成加合物和交联，影响溶解、酶解及可检测肽段。加热等解交联(crosslink reversal)处理可改善提取，但在约 100–200 pg 的分析量级下仍需评价回收与偏倚。FFPE 并非完全无法开展单细胞尺度蛋白研究：FAXP 将组织膨胀、图像引导微切割与凝胶内酶解结合，已报告 FFPE 小鼠肝组织的单细胞形态区域分析（Dong et al., 2026）。这类切片区域与完整悬液细胞的取样单位不同，也不能据此保证所有存档组织和目标蛋白均有相同表现。
第二，通量与成本。SCoPE2 的单核/巨噬细胞研究报告约 200 个细胞/24 h，1,490 个细胞累计使用 10 天机时（Specht et al., 2021）；nPOP 协议可在 1–2 天制备 3,000 余个单细胞（Leduc et al., 2024）。两者分别描述特定采集和制备流程，不能直接拼接为临床全流程通量。按每人千细胞、百人队列计算，共有十万个细胞；若仍采用 200 个/天的估算，单采集就约需 500 天，而不是数周。预算还应包括质控、失败重测、人工、耗材与患者样品周转时间。
第三，标准化与批间可比。多中心的前处理、仪器状态与操作者差异可能与患者分组混杂。4.6 节的随机化、平衡设计、共同参考样品与跨批重复因此需要前置安排。社区白皮书提供了实验设计、基准评测与报告原则（Gatto et al., 2023），有助于检查误差来源，但遵循报告规范并不等于完成临床分析性能验证。跨中心标志物研究还需预先规定可接受误差、质控阈值和样品失败规则。
第四，结果解释与临床价值。应区分三个层次：发现研究提出候选蛋白或分层规则；分析性能验证检验准确度、精密度、检出限和干扰；临床验证评估结果与疾病或结局的关系。若声称检测具有临床效用，还需证明据此采取的措施能够改善结局或决策质量。候选物可以转为抗体检测，也可保留质谱平台；关键是锁定测量与判读规则，在独立数据中检验，并妥善处理缺失、填补、批次和多重比较。
5.6.4 与现有临床蛋白检测的分工
免疫组化(immunohistochemistry, IHC)、流式细胞术与 ELISA 已有成熟的特定临床检测，但其参数数目、样品需求与成本并不一致。常规面板可检测一至十余种蛋白，也有参数更多的流式或成像方案；每种检测仍需按具体用途验证。单细胞质谱适合探索更广的蛋白集合，面板检测则便于围绕既定靶标组织测量。表 5.6-1 概括常见研究设计中的差别，不能代替特定产品的性能比较。
| 方法 | 一次可测 | 样品需求 | 通量与成本 | 现阶段临床角色 |
|---|---|---|---|---|
| 免疫组化（IHC） | 一至数种蛋白，原位 | FFPE 切片，兼容存档 | 成熟病理流程；成本取决于标记与判读 | 已有特定病理与伴随诊断检测 |
| 流式细胞术 | 常规数种至十余种；亦有更高参数面板，需控制光谱重叠 | 悬液细胞，事件数要求高 | 可达每秒千级至上万事件；取决于系统与样品 | 免疫表型的临床常规 |
| ELISA | 一至数种蛋白 | 微升级体液或裂解液 | 适合批量测定；成本随试剂与自动化程度变化 | 常规定量检测与筛查 |
| 质谱流式（CyTOF） | 数十个蛋白参数（含磷酸化） | 悬液细胞，事件数要求高 | 常为每秒数百事件；全流程另含制备与质控 | 研究为主，临床表型探索 |
| 质谱单细胞蛋白组 | 适当条件下可达数千种；受细胞类型与流程影响 | 单个细胞（约 100–200 pg 蛋白） | 文中案例可达约百级细胞/天；非普遍上限 | 本文案例主要用于发现与方法研究 |
发现任务与检测任务。发现研究重在产生可检验的候选标志物，评价时也必须控制误发现；检测开发则需要稳定的测量与判读规则，并验证具体用途。两者是研究任务的区别，不是仪器的固定分类。候选蛋白可转为一至数个抗体构成的面板，也可在经过验证的质谱流程上继续研究（Guo et al., 2025）。若更换平台，需要确认两种方法测量的分子对象、动态范围与判读阈值能够衔接；平台切换本身不能保证候选物有效。
图 5.6-3 给出一种可选路径：在数十例患者中探索微环境特征与治疗响应的关联，选择候选规则，再尝试转为两三个或少数抗体组成的面板，最后在独立前瞻队列中验证。简化面板是否保留原规则的信息必须实测；某些状态可能需要更多标志物。各阶段患者数应由预期效应、事件率、误差与功效决定，数百例也不是自动充分的验证规模。
5.6.5 证据边界与主要限制
本节所列的 CTC 表型、培养细胞深度与药物扰动结果，分别回答了特定研究问题；它们未直接证明某个检测能够改善患者结局。研究用途(research use only, RUO)还可作为具体产品的预期用途标识，应与论文处于探索阶段的描述区分。不能仅凭这些论文，断言全球所有单细胞蛋白检测的监管状态。
灵敏度、可重复性和临床验证仍是并存的限制。HeLa 等培养细胞中数千种蛋白、约半数表达蛋白的覆盖，说明深度取得进展，却不保证稀有患者细胞的低丰度受体、转录因子或修饰位点均可稳定定量。若目标信号达不到要求，首先需要改善制备与分析性能；若目标已可可靠测量，则跨中心标准化、通量成本及前瞻验证可能成为主要限制。应按样品、目标蛋白与临床终点确定优先级，而不是宣布某一类限制已普遍解决（Ye et al., 2025；Gatto et al., 2023）。
习题 5.6-2
考虑三个限制：甲“目标蛋白灵敏度不足”，乙“标准化与批间可比未建立”，丙“前瞻验证资源有限”。能否仅凭本节的培养细胞深度为三者作统一排序？分别讨论目标蛋白经常缺失和目标已稳定定量两种情形，并评价“覆盖约半数表达蛋白即可排除甲”的推理。
参考解答不能统一排序。若患者样品中的目标蛋白经常缺失或误差过大，甲会直接限制后续研究，应先评价提取、背景和采集性能，同时建立基本质控。若目标已稳定定量，乙与丙可能更紧迫：需要验证跨批与跨中心误差，并在资源允许的独立队列中检验预先规定的终点。约半数的总体覆盖率不能说明恰好包含所需靶标，更不能保证其定量准确度，因此不能排除甲。标准化和前瞻研究也可并行规划，顺序应由具体性能证据与研究目的决定。
5.6.6 设计练习：前瞻探索研究示例
设想一项前瞻探索研究，以“免疫治疗后肿瘤微环境中耗竭样 T 细胞比例的配对变化”为终点。每位患者在治疗前和治疗两周期后各取样一次，并预先规定耗竭样表型的判定方法。配对设计可减少部分患者间基线变异，但改善程度取决于前后相关性；缺少适当对照时，也不能把所有时间变化都归因于治疗。以下人数与细胞数用于说明设计计算，并非推荐的临床方案。
样本量与机时的示例估算。若需要 32 例可分析患者，预计约 20% 脱落或样品失败，则初步招募 40 例。设每例每时间点随机分析 100 个细胞，采用 TMT 多重标记，另设 200 个细胞的载体与空白通道，并按 4.6 节平衡批次。主要终点仍是耗竭样 T 细胞比例的配对变化；相关蛋白模块评分可列为预先规定的次要终点。100 个随机细胞是否足以估计目标比例，需要依据 T 细胞及目标亚群频率先行评估。40 × 2 × 100 = 8,000 个细胞，按假定的 200 个/24 h 计算约需 40 天连续采集，尚不含额外质控与重跑。40 参数的质谱流式面板可能缩短采集，但其靶标覆盖、事件数与固定兼容性也需验证；并行使用可提供补充证据，不能自动视为临床确认。
习题 5.6-3
为“标志物发现到人群验证”设计两阶段框架：列出每阶段的患者数、取样、平台、终点与统计控制，并说明同一平台和更换平台分别需要哪些验证。患者数可使用本节示意范围，但须指出正式计算还缺少哪些信息。
参考解答阶段一可设 40–50 例治疗前后配对探索，采用单细胞质谱并辅以适当亲和检测；报告效应与不确定性，控制多重比较，且在进入验证前锁定候选物、模型和阈值。阶段二可暂以 300–500 例独立前瞻队列讨论，评价预先规定的临床关联，如与无进展生存的关系；正式人数还需效应量、事件率、失访率和功效要求。验证可沿用性能已确认的同一平台，也可转为两三抗体或更完整的流式/IHC 面板；后者需完成方法学衔接，确认简化面板保留所需信息。避免探索偏倚主要依靠独立患者、冻结的分析和设盲判读，更换测量原理并不能消除多重比较偏倚。与结局相关仍不等于证明检测指导治疗能够获益。
评估一项单细胞蛋白组临床研究时，可逐项检查：
- 研究对象：细胞类型、疾病阶段、保存方式与目标蛋白是否明确，培养细胞性能是否被误当作患者样品性能；
- 分析证据：回收、检出率、定量误差和跨中心可比性是否在实际样品中验证，细胞数是否足以测量目标亚群；
- 研究设计：终点、样本量、批次安排、缺失处理和失败规则是否预先规定，验证患者是否独立；
- 结论层级：结果支持方法可行性、临床关联还是决策获益，结论是否超出研究设计。
5.7 节汇总进一步查找工具、数据与社区资源的入口。
关键术语
- 肿瘤微环境 (tumour microenvironment, TME)
- 肿瘤细胞及其周围免疫、基质细胞和细胞外成分构成的局部环境。
- 循环肿瘤细胞 (circulating tumour cell, CTC)
- 进入外周血的肿瘤细胞，检出数量随癌种、疾病状态和富集检测方法变化。
- 液体活检 (liquid biopsy)
- 分析血液等体液中的疾病相关成分的检测方式，CTC 是其中一种分析对象。
- 细针穿刺 (fine-needle aspiration, FNA)
- 以细针抽吸取得病灶细胞的取样方式，收获量与病灶及操作条件有关。
- 福尔马林固定石蜡包埋 (formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE)
- 常用组织保存方式，固定交联和包埋使蛋白分析需要专门前处理。
- 解交联 (crosslink reversal)
- 通过适当处理减少固定形成的交联，以改善蛋白或肽段提取的过程。
- 上皮-间充质转化 (epithelial–mesenchymal transition, EMT)
- 上皮细胞获得间充质表型的状态连续谱，CTC 分群的常用维度。
- T 细胞耗竭 (T cell exhaustion)
- 慢性抗原刺激相关的 T 细胞功能与分化状态，需结合多种表型和功能证据判断。
- 质谱流式细胞术 (cytometry by time-of-flight, CyTOF)
- 金属同位素标记抗体的高参数单细胞蛋白测量方法。
- 伴随诊断 (companion diagnostic)
- 为特定药物或生物制品的安全有效使用提供必要信息的检测。
- 研究用途 (research use only, RUO)
- 具体产品仅用于研究的预期用途标识；不等同于整个技术平台的统一监管状态。
- 前瞻验证 (prospective validation)
- 按预先规定的方案随访并检验候选检测表现的研究；临床关联与临床效用需分别评价。
参考文献与延伸阅读
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- Payne K, Brooks J, Batis N, et al. 2023. Feasibility of mass cytometry proteomic characterisation of circulating tumour cells in head and neck squamous cell carcinoma for deep phenotyping. British Journal of Cancer 129: 1590–1598.
- Bendall SC, Simonds EF, Qiu P, et al. 2011. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science 332: 687–696.
- Ye Z, Sabatier P, et al. 2025. Enhanced sensitivity and scalability with a Chip-Tip workflow enables deep single-cell proteomics. Nature Methods 22: 499–509.
- Specht H, Emmott E, Petelski AA, Huffman RG, Perlman DH, Serra M, Kharchenko P, Koller A, Slavov N. 2021. Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2. Genome Biology 22: 50.
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