1.2遗传图谱：标记、连锁与重组

1913 年，摩尔根实验室的研究生 Alfred H. Sturtevant 意识到：若两个基因位于同一条染色体上，它们被减数分裂重组分开的频率随两点间距离增大而升高，则重组频率本身即可充当染色体上的距离尺。他在整理数据之后绘出果蝇 X 染色体上六个基因的线性顺序图，遗传学由此获得第一张遗传图谱(genetic map)（Sturtevant, 1913）。一个世纪之后，人类基因组计划的第一项目标仍是这把尺子：以多态性标记为路标、以重组率为距离量度的全基因组坐标系统。本节依次讨论标记从何而来（1.2.1）、重组率如何定义与测量（1.2.2）、如何校正为可加的图距（1.2.3）、用什么群体去数重组（1.2.4），以及遗传图的用途与局限（1.2.5）。

1.2.1分子标记：从表型路牌到序列路标

经典连锁分析所用的标记是表型可辨的等位差异——孟德尔的豌豆花色、摩尔根的果蝇翅形。这类标记受三重限制：数量稀少，一个杂交组合往往只能跟踪少数几个位点；分布不可控，无法按需要加密；多数影响表型乃至适合度，本身受选择牵连。现代遗传图改用分子标记(molecular marker)：基因组 DNA 序列自身的多态性。理想的作图标记应数量近乎无限且均匀覆盖全基因组；大多位于非编码区，对表型与适合度的影响可忽略；检测方法可标准化、可自动化；并尽可能共显性，即能直接区分纯合与杂合。

四代主流标记先后承担了这一角色，其更替主要由检测通量驱动（表 1.2-1）。第一代 RFLP 基于限制酶切位点的有无：个体间一个碱基的差异若创建或破坏了酶识别位点，Southern 印迹上探针杂交带的长度随之改变。Botstein 等（1980）系统论证了 RFLP 可作为构建人类遗传连锁图的通用标记，并随之定义了衡量标记信息量的多态信息量(polymorphism information content, PIC)——一个标记在给定群体中能够提供连锁信息的概率。按此定义，双等位位点的 PIC 上限为 0.375，而多等位的微卫星常在 0.5 以上。

RFLP 之后，AFLP 把基因组 DNA 酶切片段与接头连接后做选择性 PCR，无需任何先验序列信息即可在一张胶上同时显示数十至上百个位点，特别适合基因组研究刚起步的物种，但多数条带表现为“有或无”，属显性标记。SSR 以 (CA)_n 等串联重复数目的变异为基础，一对引物 PCR 即可读出基因型：杂合体两条带皆可见（共显性），等位基因数目多，单位点信息量高，因而撑起了 20 世纪 90 年代的人类与小鼠高密度遗传图（Dib et al., 1996；Dietrich et al., 1996）。SNP 是单个碱基的替换，在人类基因组中平均每 600–1 000 bp 即出现一处，数量远超其他各类标记；其双等位本质使单位点信息有限，但芯片与重测序可同时分型数百万位点，以密度补偿了单位点信息量。标记方案的每次换代，都直接缩短了构建一张全基因组图谱所需的时间。

实际选择标记时还需权衡：是否已有参考序列、DNA 的数量与质量、目标分辨率与预算。AFLP 适合“零信息”起步，SSR 兼顾信息量与成本，SNP 面向大规模自动化分型。标记密度直接决定图的分辨率：RFLP 时代的人类图分辨率以 10 cM 计，微卫星时代细化到厘米级以下，SNP 芯片则奠定了第 3 章大规模变异分析的基础。

1.2.2连锁与重组：以交换为尺

连锁(linkage)指同一染色体上的位点倾向于共同遗传；打破这种连带的是减数分裂前期 I 中同源染色体之间的交换(crossing over)：非姐妹染色单体在交叉处断裂并互换远端片段，从而产生亲本染色体上不存在的等位基因组合，即重组型配子。两位点相距越远，其间发生交换的机会越大，重组型配子的比例越高——这正是 Sturtevant 把重组频率当作距离尺的依据。

由于每次交换只涉及四条染色单体中的两条，任一单次交换至多使半数配子成为重组型，故 θ 以 0.5 为上限；两点相距极远或位于不同染色体时 θ = 0.5，与自由组合无异。距离单位由此定义：1% 重组率记为 1 厘摩(centimorgan, cM)，100 cM = 1 摩根（Morgan），以纪念连锁图的奠基者摩尔根。在人类基因组中 1 cM 平均约合 1 Mb，但这只是量级上的平均，各区段伸缩极大（见 1.2.5 与 1.3 节）。

然而重组率并非完美的尺子：当两点之间发生偶数次交换时，两点自身的等位组合恢复亲本构型，这类交换对 θ “隐身”，不计入分子。距离越远，双交换及更高次交换的概率越大，θ 对真实交换次数的低估越严重。因此两点测交只适合较短的区间；更长距离的可靠作图依赖两条途径——三点测交(three-point testcross)直接观测双交换并判定基因顺序，作图函数则从统计学上补偿多次交换（1.2.3 节）。

三点测交一次杂交同时分析三个连锁位点：三杂合体与三隐性纯合体测交后，子代表型直接反映 F1 配子的基因型，八类计数隐含三个位点的顺序与两个区间的图距。判读要点有二。其一，计数最少的两类恰为双交换类，把它们与最多的亲本类比较，唯一发生“翻转”的位点必位于中间——这是判定基因顺序最直接的办法。其二，计算区间重组率时，双交换必须同时计入两个相邻区间；据此还可估计干涉(interference)：一次交换会抑制邻近区间再次交换，定义并发系数(coefficient of coincidence) c 为观测双交换数与期望双交换数（两区间重组率之积乘以总数）之比，干涉 I = 1 − c。多数生物中 I 大于 0（正干涉），果蝇短区间中 I 可接近 1；个别真菌中报道过与基因转换相关的局域负干涉。

1.2.3作图函数：从重组率到可加图距

重组率本身不可加。设 a–b 与 b–c 各约 10 cM（θ ≈ 0.10），a–c 两点直接测得的 θ 必小于 0.20——因为跨越两个区间的双交换在 a–c 两点间“隐身”。若把图距 m 定义为两位点间交换次数的期望值，则 m 天然可加：相邻区间的图距相加即得总图距。作图函数(mapping function)就是 θ 与 m 之间的换算关系，两个经典函数的差别在于对干涉的假设。

对同一 θ，Kosambi 给出的图距总小于 Haldane；两者在 θ 小于约 0.05 时几乎重合，在 θ 超过 0.2 后显著分离（图 1.2-2）。经验上真核生物普遍存在正干涉，Kosambi 函数与观测更接近，人类与小鼠的多数经典连锁图即按 Kosambi 换算；Haldane 函数则因其泊松推导简洁，常用作理论基准（并见于重组自交系的理论推导，式 1.2-4）。

使用作图函数时有三点值得注意。其一，作图流程是先在短区间内估计 θ，再换算为 m 并逐段相加，从而得到有序的标记框架；相邻标记间距宜设计在 10–20 cM 以内，既减小多次交换校正的误差，也便于发现顺序错误。其二，少量基因分型错误会被误读为重组，系统性抬高 θ，对三点测交中稀有的双交换类破坏尤甚，故高密度图的构建必须配合错误检测与复核。其三，两性交换率不同时应分别构建性别特异图；人类女性全基因组遗传图比男性约长六成，两图不可混用（见 1.2.5）。

1.2.4作图群体与人类家系

数重组需要群体。无论何种物种，作图群体都要满足两点：亲本在标记位点高度多态，理想情况是两亲本在不同等位基因上各自固定；群体规模足以把 θ 估计到所需精度，常用 100–300 个个体或家系。群体类型则决定“能数到几次重组”以及“基因型能否重复观测”，由此分为暂时性与永久性两大类。

F2 群体构建最快：两纯系杂交得 F1，F1 自交得 F2，每个位点按 1 : 2 : 1 分离，共显性标记可直接读出全部三类基因型；其代价是暂时性——每个 F2 个体只能观测一次，显性标记还会把三类基因型压缩为两类。回交群体（BC）把 F1 与亲本之一回交，每位点只出现两类基因型，判读最简单，同样属暂时性群体。

重组自交系(recombinant inbred lines, RIL)由 F2 单株经单粒传代连续自交（或同胞交配）至 F6–F8 获得：自交使残余杂合度按 (1/2)ⁿ⁻¹ 递减，F6 时约 3%、F8 时不足 1%，各系趋近纯合，整套群体成为可永久保存、重复取样的“冻存的重组库”。RIL 的突出优点是累积了多代减数分裂的重组：

双单倍体(doubled haploid, DH)群体把 F1 的配子诱导为单倍体后染色体加倍，一步获得完全纯合的个体：每个 DH 系相当于一个被放大并固定的配子，只含一次减数分裂的重组。DH 构建周期最短，与 RIL 同属永久群体；限制在于诱导效率因物种而异——大麦、油菜与水稻高效，而人类及多数动物不可行。

人类不能安排婚配、世代长、家系小，连锁分析只能利用现有家系回顾地进行，方法上有三个特点。其一，相位（等位基因在亲本同源染色体上的搭配）常不可直接得知，须由家系信息推断。其二，有效作图单位是家系而非个体，单个家系提供的重组观测有限，故须汇集参考家系（如 20 世纪 80 年代建立的 CEPH 三代家系库）累积数据。其三，统计上以参数连锁分析为主：对给定 θ 计算家系似然，与 θ = 0.5 的零假设比较，常用 LOD 值（似然比取常用对数）判定连锁，LOD 不小于 3 为经典阈值，系统方法见 Ott（1999）。对不确定遗传模式的复杂疾病，患病同胞对(affected sib-pair)等非参数方法不以模型为先决条件：若同胞在某标记区段共享的亲源同一等位比例显著偏离期望的 1/4 : 1/2 : 1/4，即提示该区段含易感位点；微卫星的高杂合度使亲源同一性估计精确，是同胞对时代的主力标记。

1.2.5遗传图的用途与局限

遗传图的首要用途是提供坐标系。有了按图距排序、覆盖全基因组的标记框架，任何可测的表型差异都能反过来追问“控制它的位点落在哪个区间”。这一思想即数量性状位点定位：在作图群体中同时记录标记基因型与表型，寻找与表型共分离的区间（方法详见 3.4 节）。永久群体使同一基因型可多年多点重复观测，把定位从宽区间逐步推进到候选基因数目有限的量级。定位克隆时代的第一批疾病基因——如 1989 年鉴定的人类囊性纤维化基因 CFTR——同样先靠家系连锁锁定区间，再到物理图上获取 DNA 克隆（衔接 1.3 节）。

遗传图也是比较作图(comparative mapping)的语言。亲缘物种之间基因顺序在大尺度上保守，即同线性(synteny)：用同一批或同源的标记在两个物种中分别作图，即可把一个物种的基因顺序投影到另一个物种——人类与小鼠之间可识别出数百个保守同线块，水稻、小麦、玉米等禾谷类作物之间亦存在良好共线性。比较作图使研究基础薄弱的物种借用模式物种的图谱信息定位自身基因，也为染色体进化研究提供直接证据。

遗传图还是物理图的锚。遗传标记的旁侧序列可转化为序列标签位点（见 1.3 节），用以筛选大片段克隆、把重叠群锚定到连锁框架上；在全基因组鸟枪装配中，遗传图的标记顺序是检验装配正确性的独立证据。两把尺子互相校核，才有可靠的染色体坐标。

最后必须指出遗传图的边界：图距度量的是重组机会，不是 DNA 长度。重组在染色体上的分布极不均匀——着丝粒附近受到抑制，亚端粒区与重组热点则交换频繁；女性重组总体多于男性，全基因组女性遗传图约 4 300 cM、男性约 2 600 cM，平均约 1.6 : 1。因此“1 cM 约合 1 Mb”仅在平均意义上成立，遗传图上等距的两段 DNA，物理长度可相差数倍。厘摩与碱基对之间的非线性关系及其对作图实践的影响，详见 1.3 节。