上一节的遗传图谱以重组率为单位回答"标记之间的相对次序"，却无法回答两个更具操作性的问题：两个标记之间究竟隔着多少碱基对？这段 DNA 可以从哪里"拿到手"？回答它们需要第二套坐标系统——物理图谱(physical map)：以真实存在的 DNA 分子（克隆、探针、带纹、序列）为界标、以 bp / kb / Mb 为距离单位的图谱。按分辨率自低到高，物理图通常包括三个层次：对应中期染色体带纹的细胞遗传图（Mb 级）、由相互重叠的大片段克隆排成的重叠群图（约 100 kb 级），以及最终的序列图（单碱基级）。本节的主题是中间这一层：如何把数以十万计的随机克隆变成有序、无缝、可及的基因组资源。
1.3.1 克隆体系与文库覆盖度
物理作图的原料是克隆文库(clone library)：将基因组 DNA 随机打断成片段，分别装入载体并转入宿主保存，得到的克隆总体即构成基因组的一个"随机样本库"。载体系统的选择决定了文库的三个关键参数——插入片段长度、克隆稳定性与构建通量。二十世纪八十至九十年代发展出的三代大片段载体各有定位：
黏粒(cosmid)把 λ 噬菌体的 cos 位点接到质粒骨架上，可借助体外包装系统导入细菌，携带约 40 kb（35–45 kb）的外源 DNA，构建快、滴度高，是早期小基因组与局部区域作图的主力。细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)以大肠杆菌 F 因子为基础构建：F 因子具有低拷贝、严紧型复制与主动分配（par 基因）机制，使 100–200 kb（个别可达约 300 kb）的人类 DNA 片段在大肠杆菌中稳定传代，且嵌合率极低（Shizuya et al., 1992）。酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)则在酵母中重建一条微型染色体（着丝粒、端粒与复制起点 ARS），容量可达 0.1–1 Mb，是当时唯一能横跨超大间隙的载体，但其克隆稳定性与忠实性存在系统性缺陷（见下文警示框）。
| 载体系统 | 遗传基础与宿主 | 典型插入长度 | 主要优点 | 主要局限 |
|---|---|---|---|---|
| 质粒 | 高拷贝质粒 · 大肠杆菌 | 10 kb 以下 | 构建与测序简便 | 容量过小，无法覆盖大基因与结构域 |
| 黏粒 | λ cos 位点 + 质粒 · 大肠杆菌 | 约 35–45 kb | 构建快、滴度高、易纯化 | 容量有限，大基因组所需克隆数巨大 |
| 细菌人工染色体（BAC） | 大肠杆菌 F 因子（低拷贝、严紧分配） | 约 100–200 kb | 高度稳定、嵌合率极低、可高通量 PCR 筛选 | 容量不及 YAC，制备稍繁 |
| 酵母人工染色体（YAC） | 着丝粒–端粒–ARS 人工染色体 · 酿酒酵母 | 约 0.1–1 Mb | 容量最大，可横跨大间隙 | 嵌合率高、部分克隆不稳定 |
文库的代表性由取样方式决定。若用限制酶部分消化(partial digestion)——在酶量与反应时间受控的条件下"浅切"，使平均每数十至数百 kb 才随机断开一处——则每个位点是否进入文库近似与其序列无关；反之，完全消化会系统性地丢弃不含该酶切位点的区域，造成覆盖偏差。常用策略是以识别 4 碱基（如 MboI / Sau3AI，与载体 BamHI 位点兼容）或 6 碱基（如 HindIII）的酶部分消化高分子量 DNA，再经脉冲场凝胶电泳（PFGE）按大小选出目标区间。机械剪切（雾化、超声）产生的断裂位点几乎完全随机，但需末端修补与加接头，多用于测序亚文库而非大片段主文库。无论何种方式，随机取样的目标是同一条：让基因组每个片段以大致相等的概率进入克隆集合。
随机取样必然带来"覆盖不完全"的风险，其数学描述来自泊松模型。设文库含 N 个独立克隆，平均插入长度 L，单倍基因组大小 G；任一碱基被任一指定克隆覆盖的概率为 L/G，N 个克隆皆不覆盖的概率为 (1 − L/G)N，当 L 远小于 G 时可用指数近似（Clarke & Carbon, 1976；Lander & Waterman, 1988）：
数值估算可以说明问题的量级。取人类基因组 G ≈ 3.1×10⁹ bp、BAC 平均插入 L ≈ 150 kb：要达到 c = 5 倍覆盖，需 N = cG/L ≈ 5 × 3.1×10⁹ ÷ 1.5×10⁵ ≈ 1.0×10⁵ 个克隆，约合 270 块 384 孔板；此时任一位点未被覆盖的概率为 e⁻⁵ ≈ 0.7%，即 P ≈ 99.3%。若要求 P = 99%，需 c = −ln(0.01) ≈ 4.6；c = 10 时 P ≈ 99.995%。实际工程中还要预留冗余：克隆并非严格随机（酶切位点偏好、宿主毒性导致的克隆缺失、重复区不稳定），故大型计划常构建 5–10 倍覆盖，并以不同酶与不同插入尺度的第二文库互补（Gibson & Muse, 2009）。
BAC 文库的构建与筛选。一个合格的文库须同时满足片段足够大、覆盖近随机、克隆稳定传代三项要求，标准流程如下：
- 制备高分子量 DNA：将细胞包埋于低熔点琼脂糖凝胶块中原位裂解，避免操作剪切，保住兆碱基级完整 DNA；
- 部分消化与尺寸选择：以 MboI / HindIII 等部分消化，PFGE 分离并回收 100–200 kb 区间；
- 连接与转化：片段连接入经脱磷酸的 BAC 载体，电击转化大肠杆菌感受态细胞；
- 入库：转化子逐个挑入 384 孔板，−80 ℃ 冻存，每块板即基因组随机取样的一份切片；
- 质量核查：随机抽样检测平均插入长度与空载率，按式 (1.3-1) 核算实际覆盖倍数；
- 筛选：菌落杂交（平板克隆转膜后探针杂交）或更快的 STS-PCR 池化筛选——将 384 孔板按行、列合并为 16 + 24 = 40 个混合池，每个 STS 只需 40 管 PCR 即可回溯阳性克隆。
筛选到阳性 BAC 后，即可以其为起点进行染色体步移（见 1.3.5）。
YAC 的嵌合体问题。YAC 容量虽大，但构建过程中不相邻的两个（或多个）基因组片段可能被连接进同一条人工染色体，形成嵌合体克隆(chimeric clone)。早期人类 YAC 文库的嵌合率普遍在 10%–50% 量级，加之部分克隆在传代中缺失、重排，若不加检验地据此作图，会把基因组上毫不相邻的区域错误地连在一起，误导后续的基因定位与测序。排查手段（如与独立图谱比对、荧光原位杂交验证）成本高昂。正因如此，人类基因组计划最终放弃以 YAC 而改用稳定性好得多的 BAC 构建物理图——"够大且稳"胜过"最大"。
习题 1.3-1
某植物基因组 G ≈ 4.0×10⁸ bp（约 400 Mb）。拟构建平均插入 L = 120 kb 的 BAC 文库，要求任一位点被覆盖的概率不低于 95%。(1) 至少需要多少克隆？相当于多少块 384 孔板？(2) 若改用平均插入 35 kb 的黏粒文库，达到同样覆盖需要多少克隆？(3) 由此说明插入片段大小对文库工程量与重叠群拼装的影响。
参考解答(1) P = 0.95 ⇒ c = −ln(1 − P) = −ln(0.05) ≈ 3.0；N = cG/L = 3.0 × 4.0×10⁸ ÷ 1.2×10⁵ = 1.0×10⁴ 个克隆，约 26 块 384 孔板。(2) N = 3.0 × 4.0×10⁸ ÷ 3.5×10⁴ ≈ 3.4×10⁴ 个，约为 BAC 文库的 3.4 倍。(3) 覆盖概率只取决于倍数 c = NL/G，故平均插入每缩小 k 倍，所需克隆数、PCR 筛选与拼装的组合数目都同比膨胀；更大的插入片段还能跨过更多重复序列、提供更长的搭接，这正是 BAC 成为大基因组物理图主力载体的原因。
1.3.2 STS 内容作图与重叠群拼装
序列标签位点(sequence tagged site, STS)：一段长约 200–500 bp、在基因组中仅出现一次（单拷贝）的短序列，其两端设计一对 PCR 引物后，即可用扩增反应的有无来检测"该序列是否存在于某个克隆或 DNA 样品中"。STS 的价值不在其序列本身，而在于它把任何实验室、任何载体中的 DNA 样品都纳入同一套可相互比对的语言（Olson et al., 1989）。来自 cDNA 的表达序列标签（EST）经确认唯一样同样可用作 STS，从而把基因直接钉在物理图上。
STS 内容作图(STS content mapping)的原理只有一句话：若两个克隆共享至少一个 STS，它们在基因组上必然物理重叠。将一批 STS 逐一用于池化 PCR 筛选文库，即可得到"克隆 × STS"的阳性矩阵；矩阵中共享模式的传递性（A 与 B 共享 S3，B 与 C 共享 S4，……）把克隆连成链，链的并集就是重叠群(contig)。STS 的排列次序则由共出现模式推断：被同一批克隆"先后"包裹的 STS 相邻，而仅共同出现在单一克隆中的两个 STS 次序不可分辨——这是内容作图固有的分辨率极限，需由指纹图或末端序列补充（图 1.3-1）。
指纹作图(fingerprint mapping)提供互补信息：将每个克隆单独用限制酶完全消化，凝胶分离得到一组特征带型；两克隆带型重合的程度反映其重叠的长度，而不仅是有无。Coulson 等（1986）在秀丽隐杆线虫物理图计划中系统发展了这一策略，以带型巧合概率（后被称为 Sulston 分数）判读重叠的统计显著性。FPC（FingerPrinted Contig）软件随后把指纹带型、STS 标记与克隆重叠的概率推理整合为半自动流程，支撑了人、鼠、线虫等大型重叠群图的构建（Söderlund et al., 2000）。STS 给出锚点与基因组全局坐标，指纹给出重叠的精细程度，二者结合才能既快又准地把随机克隆拼成覆盖全基因组的重叠群（International Human Genome Sequencing Consortium, 2001）。人类基因组计划最初设定的物理图目标——间隔约 100 kb 的 3 万个 STS——在 1995 年即以 15,086 个 STS（平均间距约 199 kb）的版本先行达成（Hudson et al., 1995）。
习题 1.3-2
对某染色体区域 5 个 BAC 克隆做 6 个 STS 的 PCR 检测，阳性模式为：A{S1, S2, S3}；B{S2, S3, S4}；C{S4, S5}；D{S3, S4, S5}；E{S5, S6}。(1) 给出与全部数据相容的 STS 排列次序；(2) 指出一个冗余克隆并说明判据；(3) 仅凭该矩阵能否确定 S1 与 S2 的先后次序？为什么？
参考解答(1) S1–S2–S3–S4–S5–S6（整体反向同样相容，作图本身不区分方向，需染色体坐标或带纹信息定向）。(2) D：其携带的 S3、S4、S5 均已被 B 与 C 的组合覆盖，删除 D 后克隆链的连通性不变，故对建立骨架属冗余——但它提高了 S4–S5 区的覆盖深度，对测序与补缺仍有价值。(3) 不能。S1 与 S2 只共同出现于克隆 A，把二者对调后的矩阵完全相同；只有当两个 STS 被"先后被不同克隆共享"的模式分开时，其相对次序才可分辨。这是 STS 内容作图的分辨率极限之一，需借助指纹图、克隆末端序列或 FISH 等独立信息补充。
1.3.3 其他物理作图途径：FISH、辐射杂种与光学图
克隆重叠群图之外，还有两类坐标来自完全不同的技术路线，它们把分子图谱与更宏观的染色体结构挂钩。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)将荧光标记的 DNA 探针直接杂交到中期染色体标本上，在显微镜下确定这段序列位于哪条染色体、哪条带纹（如 1p36.3），从而把克隆锚定到细胞遗传学坐标。其分辨率随标本状态改善而提高：中期染色体上两探针需相距约 1–3 Mb 方可分辨，间期核中约 100–500 kb，而将 DNA 拉直的纤维-FISH 可达数 kb 量级。FISH 的优势是直观、不依赖文库，且天然覆盖着丝粒异染色质等克隆与测序困难的区域；不足是通量低、精度有限，主要用作低分辨率骨架与验证手段。
辐射杂种图(radiation hybrid, RH map)则把"距离"转化为统计学量：先用高剂量辐射（典型 3,000–10,000 rad）将人类染色体打断成随机片段，再与仓鼠等啮齿类细胞融合，得到一组各自保留不同人类片段的杂种克隆群。每个标记在各杂种克隆中"保留"或"丢失"构成其二进制特征；两个标记的保留模式越相似，说明它们在断裂—保留过程中被一起携带的概率越高，即物理距离越近，其距离以 centiRay（cR，与辐射剂量绑定）为单位。RH 图不依赖多态性、分辨率介于遗传图（cM）与重叠群图（kb）之间，在 20 世纪 90 年代是长程排序与图整合的关键坐标层。此外，将单个 DNA 分子拉直后用限制酶原位切出切口、直接读出长分子酶切模式的光学作图（酶切图）在原书出版后发展为构建大跨度骨架的常规手段，尤其擅长跨越重复区（Gibson & Muse, 2009）。
1.3.4 遗传距离与物理距离的非线性
初学者常把"1 cM ≈ 1 Mb"当作处处适用的换算率，这是必须纠正的观念。遗传图距度量的是重组的机会，物理图距离度量的是 DNA 的长度，两者之间没有常数比例。三点证据层层递进。其一，性别差异：女性减数分裂的交换总体多于男性，全基因组遗传图女性约 4 400 cM、男性约 2 700 cM，比值约 1.6 : 1（不同家系研究估计相近，如 Genethon 微卫星图；Dib et al., 1996）——同一段 DNA 在两性中要用两把刻度不同的尺子度量。其二，区域差异：重组在染色体上的分布极不均匀，近着丝粒异染色质区交换被强烈抑制，而重组热点可在数 kb 内集中远超平均的交换，亚端粒区重组亦偏活跃；结果是一条染色体上同样 6 Mb 的两段，可以贡献约 5 cM，也可以只贡献约 1 cM 量级（图 1.3-2A）。其三，即便取全基因组平均，换算率也只是量级近似（见下方注记）。
"1 cM ≈ 1 Mb"从何而来。以两性平均图长约 (4 400 + 2 700) / 2 ≈ 3 550 cM、基因组约 3 100 Mb 计，平均约 0.87 Mb 对应 1 cM（女性约 1.42 cM/Mb，男性约 0.87 cM/Mb）。"1 cM ≈ 1 Mb"只是把 0.87 四舍五入到量级的记忆规则；由于重组率沿染色体可相差两个数量级以上，任何把 cM 直接换算成 bp 的做法都只在统计意义上成立。定位克隆时代的一个直接后果：疾病位点经连锁分析初定位到 1–2 cM 区间后，对应的物理距离可能在 1 Mb 之内，也可能超过 10 Mb，必须回到物理图上逐段落实。
习题 1.3-3
人类女性遗传图全长约 4 400 cM，男性约 2 700 cM，单倍基因组约 3 100 Mb。(1) 分别计算两性平均每 Mb 对应的 cM 数；(2) 女性图中相距 1.5 cM 的两个标记，按全基因组平均估计相距多少 DNA？(3) 该估计在近着丝粒区或重组热点附近为何会严重失真？
参考解答(1) 女性 4 400 / 3 100 ≈ 1.42 cM/Mb；男性 2 700 / 3 100 ≈ 0.87 cM/Mb。(2) 1.5 cM ÷ 1.42 cM/Mb ≈ 1.1 Mb。(3) 平均换算率掩盖了分布的极端不均匀：近着丝粒异染色质区交换被强烈抑制，同长 DNA 贡献的 cM 远低于平均（1.5 cM 可能对应远超 1.1 Mb 的 DNA）；重组热点则相反，数 kb 内即可集中 1 cM 以上的交换。因此 cM 与 bp 之间不存在可靠的一一换算，遗传图定位后必须经物理图落实区间。
1.3.5 染色体步移与图谱整合
有了文库与路标，从"标记"走向"分子"的桥梁是染色体步移(chromosome walking)：以某标记（如疾病连锁位点的侧翼 SSR 或 SNP）为探针或 STS 引物筛选文库，得到阳性克隆；测定该克隆的远端末端序列并发展为新的 STS，再回文库筛选与之搭接的新克隆；如此交替"测末端—筛文库"，沿染色体逐克隆推进，直至抵达目标基因。若对文库所有克隆的两端统一测定一条末端读长（序列标签连接子策略），则每次步移只需在末端序列数据库中检索即可完成，步移被大规模并行化。步移的局限同样明显：步幅受限于平均插入长度，在重复序列区若末端落在重复元件上会"跳"到基因组别处；每一步都要回到文库，属局部而非全局策略。因此大计划最终以覆盖全基因组的重叠群图加最小铺砌路径(minimum tiling path)——一列首尾搭接、总冗余最小的克隆——取代逐步 crawling，为分级测序提供施工路线（见 1.4 节）。
物理图真正的杠杆作用在于整合。STS 被 Olson 等（1989）提议为物理作图的"公共语言"：遗传图上的微卫星或 SNP 位点一经确认为单拷贝，即可转为 STS 检测；物理图上的克隆以 STS 锚定排序；细胞遗传图上的带纹可由 FISH 探针（往往就取自某个克隆）对应到 STS；最终的序列图则以坐标形式收编所有 STS。同一批路标贯穿四层地图，任何一份新数据——一个新基因、一个疾病位点、一条 cDNA——都能立即挂到统一坐标系上。定位克隆时代的经典成果正是沿着这条链条完成：杜氏肌营养不良症与囊性纤维化的致病基因，都是先经连锁分析锁定区间，再依赖重叠群与步移获得候选克隆，最终在序列中识别突变。到 2001 年人类基因组工作草图发表时，以 BAC 重叠群为骨架的物理图已将约 3.1 Gb 基因组组织为可逐克隆测序的有序资源（International Human Genome Sequencing Consortium, 2001），物理图由此完成历史使命，把接力棒交给序列图与后续的功能基因组学。
关键术语
- 物理图谱 (physical map)
- 以 bp / kb / Mb 为距离单位、以实际 DNA 分子（克隆、探针、带纹、序列）为界标的基因组图谱。
- 克隆文库 (clone library)
- 将基因组 DNA 随机片段分别装入载体并保存于宿主的克隆总体，是基因组的随机取样集合。
- 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)
- 以大肠杆菌 F 因子为基础的载体，稳定携带约 100–200 kb 外源 DNA，嵌合率极低。
- 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)
- 由着丝粒、端粒与 ARS 构成的酵母载体，容量可达约 1 Mb，但嵌合与不稳定问题突出。
- 嵌合体克隆 (chimeric clone)
- 载体中连接了基因组上不相邻片段的克隆，会错误地把远处区域连入同一重叠群。
- 序列标签位点 (sequence tagged site, STS)
- 基因组中唯一样存在的 200–500 bp 序列，以一对 PCR 引物定义，可检测其在任何克隆中的存在。
- 重叠群 (contig)
- 相互重叠、按基因组真实次序排布的一组克隆或序列片段构成的连续覆盖区段。
- 指纹作图 (fingerprint mapping)
- 比较各克隆限制酶切片段带型的异同来估计重叠程度、拼装重叠群的方法。
- 荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH)
- 以荧光探针杂交中期染色体标本，将序列定位到特定染色体带纹的细胞遗传学方法。
- 辐射杂种图 (radiation hybrid map)
- 以辐射打断人类染色体后与啮齿类细胞融合的克隆群保留模式为基础的物理图，单位为 centiRay。
- 染色体步移 (chromosome walking)
- 自标记对应的克隆出发，以末端序列为新探针逐步筛取相邻克隆、沿染色体推进的策略。
- 最小铺砌路径 (minimum tiling path)
- 覆盖目标区间所需的首尾搭接、总冗余最小的克隆序列，是分级测序的施工路线。
参考文献与延伸阅读
- Gibson G, Muse SV. 2009. A Primer of Genome Science, 3rd ed. Sunderland (MA): Sinauer Associates. (Chapter 1)
- Shizuya H, Birren B, Kim UJ, Mancino V, Slepak T, Tachiiri Y, Simon M. 1992. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 89: 8794–8797.
- Olson MV, Hood L, Cantor C, Botstein D. 1989. A common language for physical mapping of the human genome. Science 245: 1434–1435.
- Coulson A, Sulston J, Brenner S, Karn J. 1986. Toward a physical map of the genome of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 83: 7821–7825.
- Clarke L, Carbon J. 1976. A colony bank containing synthetic ColE1 hybrid plasmids representative of the entire E. coli genome. Cell 9: 91–99.
- Lander ES, Waterman MS. 1988. Genomic mapping by fingerprinting random clones: a mathematical analysis. Genomics 2: 231–239.
- Söderlund C, Humphray S, Dunham A, French L. 2000. Contigs built with fingerprints, markers, and FPC V4.7. Genome Research 10: 1772–1787.
- Hudson TJ, Stein LD, Gerety SS, et al. 1995. An STS-based map of the human genome. Nature 373: 175–178 (suppl.).
- Dib C, Fauré S, Fizames C, et al. 1996. A comprehensive genetic map of the human genome based on 5,264 microsatellites. Nature 380: 152–154.
- International Human Genome Sequencing Consortium. 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860–921.