如果说 1.2 节与 1.3 节回答的是“用什么坐标系去读基因组”，那么人类基因组计划(Human Genome Project, HGP)回答的则是“谁来读、按什么规矩读、读多快”。本节按“缘起—技术路线—竞赛与合作—组织原则—伦理计划—遗产与批评”的顺序，考察这项常被称为首次“大生物学”（big biology）实验的国际工程。
1.4.1缘起与目标
1985 年 5 月，分子生物学家 Robert Sinsheimer 在加州大学圣克鲁兹分校召集会议，第一次把“测定人类基因组全序列”当作一项可以严肃论证的工程来讨论。推动构想的另一支力量来自美国能源部（DOE）：作为原子能计划的机构后继者，DOE 长期承担辐射遗传效应研究，人类全序列对它而言是度量辐射损伤的天然基线，其 1986 年圣塔菲会议与次年的顾问委员会报告先后建议立项。1988 年，美国国家研究委员会（NRC）发布《人类基因组的作图与测序》报告，给出影响深远的路线图：以 15 年为限、约 30 亿美元为预算，先遗传图、再物理图、最后序列图，并将模式生物测序与数据处理列为并行任务。同年 NIH 设立基因组研究办公室，James Watson 出任首任主管（1993 年由 Francis Collins 接任），国际人类基因组组织（HUGO）亦告成立。1990 年 10 月 1 日，HGP 正式启动。
计划的核心是三阶段目标，每前一阶段都为后一阶段提供校验坐标：
- 遗传图（第一阶段）：1990 年的五年计划要求 1995 年前建成 2–5 cM 分辨率的全基因组连锁图。法国 Généthon 实验室以微卫星标记为主力，1994 年即提前达标；1996 年版图谱收录 5 264 个微卫星、平均间距约 0.7 cM（Dib et al., 1996），把坐标密度推进到“每厘摩有路标”的量级（见 1.2 节）。
- 物理图（第二阶段）：以 STS 为统一路标。1996 年发表的 STS 图收录 15 086 个路标（Hudson et al., 1996），1998 年的整合图突破 3 万，将 BAC 重叠群锚定到染色体的具体区段（见 1.3 节）。
- 序列图（第三阶段）：沿物理图选定首尾搭接的克隆，逐个测序、按图整合，原定 2005 年完成约 3.1 Gb 的常染色质区序列。
预算数字常被概括为“每碱基一美元”：30 亿美元恰与 30 亿碱基对同量级。这一口号便于记忆，却容易误导——总预算还包括作图、模式生物基因组、数据库与信息学建设以及 1.4.5 节所述的 ELSI 伦理计划，并非全部用于人类测序本身。实际结果是：累计投入约 27 亿美元（Collins et al., 2003），2003 年 4 月宣告完成，较原定 2005 年提前两年。本节叙述以 2009 年原书出版时点为限，凡涉及其后进展均另行括注。
1.4.2两条技术路线：分级鸟枪法与全基因组鸟枪法
两条路线面对的是同一组技术约束：桑格链终止法的读长仅约 500–800 bp；而人类基因组过半由重复序列构成——散布重复约占 45%，其中 Alu 元件约百万拷贝、全长 LINE-1 约 50 万拷贝（元件全长约 6 kb）。当两条随机读段来自同一重复家族的不同拷贝时，其序列几乎无法区分，装配程序极易把它们错误连接。因此，任何策略的实质都是回答一个问题：重复序列在多大尺度上可以被“唯一化”。
国际公共联盟采用分级鸟枪法(hierarchical shotgun sequencing)：先构建覆盖全基因组的 BAC 文库（100–200 kb），经 STS 内容作图与酶切指纹把随机克隆排成重叠群，再从中挑出最小铺砌路径(minimal tiling path)——一列首尾搭接、总冗余最小的克隆——逐个独立鸟枪测序至高覆盖，最后沿图谱把克隆级装配整合为染色体级序列。其要害在于把全基因组问题切分为约 150 kb 的局部问题：在此尺度内，几乎任何重复拷贝的两侧都存在足够的唯一侧翼序列可供锚定，顺序错误即便发生也被限制在克隆内部，不会在全基因组尺度蔓延；缺口的位置也始终可由图谱追踪。代价是前期建图耗时耗力、总工序更多、起步更慢。
全基因组鸟枪法(whole-genome shotgun, WGS)则跳过作图阶段：把整个基因组随机剪断，构建约 2 kb、10 kb、50 kb 等多种插入片段大小的文库，并对每个克隆的两端测序（末端配对(mate-pair)）。读段之间的重叠提供局部拼接，而跨度已知的配对信息像卡尺一样约束相距数千乃至数万碱基的读段之间的相对位置与方向；由配对信息串联起来的连续区段称为支架(scaffold)。1995 年流感嗜血杆菌基因组证明 WGS 对小基因组可行，2000 年果蝇基因组（Adams et al., 2000）证明它可推广到重复丰富的多细胞真核生物。但读长不足 1 kb，远短于许多重复元件；当串联重复长于最大配对跨度时，WGS 只能留下缺口或给出不确定的长程顺序。为此装配器须对重复家族作保守屏蔽，并以遗传图、物理图作事后校验。
两条路线的取舍可以概括为“以信息换速度”：分级路线用前期的图谱信息购买长程顺序的确定性；WGS 用配对文库与算力置换建图的时间与经费。值得注意的是，Celera 2001 年的装配混合了自有约 2 700 万条读段（约 5.1× 覆盖）与取自 GenBank 的公共数据——这个细节本身说明，在百慕大原则之下，两条路线在数据层面早已互通。此后新一代测序时代的 de novo 装配，基本是“WGS 为主、图谱与长读长校验”的合流策略。
习题 1.4-1
某团队对一个 150 kb 的 BAC 克隆做鸟枪测序，平均读长 600 bp，计划测序至 9× 覆盖。(1) 约需多少条读段？(2) 按 Lander–Waterman 模型（式 1.4-1），未被覆盖的碱基比例约为多少？克隆内期望缺口总长约多少？(3) 实际操作中，为何 9× 之后仍需“定向补洞”阶段？
参考解答(1) 150 000 × 9 ÷ 600 = 2 250 条。(2) e−9 ≈ 1.2×10−4，即约 18 bp，通常以若干个短缺口的形式分散存在。(3) 随机模型假定读段独立均匀分布，实际存在克隆缺失嵌段、质量修剪、重复拷贝坍缩等系统性偏差；继续随机加测的边际收益递减，不如用末端步移、反向 PCR 等定向手段逐个读取残留缺口——这是“覆盖度—成本”权衡在实验室操作中的具体体现。
1.4.3竞赛与合作：从对撞到同月发表
1998 年 5 月，Craig Venter 与仪器商 PE Applied Biosystems 合建 Celera Genomics，装备约 300 台最新毛细管测序仪，宣称将以 WGS 在三年内、以数亿美元（而非 30 亿）完成人类基因组，并一度计划把数据放入公司收费数据库。公共联盟同年修订目标：把资源集中于若干大型中心、全面改用毛细管系统，将全基因组草图提前到 2001 年、完成图锁定在 2003 年。竞争的直接效果是进度——1999 年 3 月全面生产启动，至 2000 年年中，草图阶段“覆盖常染色质区约 90%”的目标已基本达成。
2000 年 6 月 26 日，克林顿在白宫宣布人类基因组工作草图完成，Collins 与 Venter 同台，布莱尔经卫星连线参与，竞赛在终点之前转为合作姿态。2001 年 2 月中旬，两篇论文同期发表：公共联盟（IHGSC）的草图刊于 Nature 409: 860–921，Celera 的草图刊于 Science 291: 1304–1351。两套草图的统计口径不同，不能直接对比，但它们给出的蛋白编码基因数估计（约 3 万余与约 2.65 万–3 万）都远低于此前教科书流行的“10 万基因”预期，这一结果本身即成为公共事件。
2003 年 4 月，联盟宣告序列目标完成，较原计划提前两年。完成图论文随后发表于 Nature 431: 931–945（IHGSC, 2004）：常染色质区约 2.88 Gb、覆盖约 99%，仅余约 340 个间隙，准确率达 99.99%（即平均每 10 000 个碱基错误不超过 1 个），满足“完成序列”的通行标准。剩余百分之几的异染色质区——着丝粒卫星阵列、近端粒区与片段重复富集区——超出当时任何路线的技术能力，直到 2022 年端粒到端粒（T2T）联盟的 T2T-CHM13 装配才被完整填补（Nurk et al., 2022；此为后话，超出原书时点）。
公共—私人竞赛（1998–2001） Celera 的入局同时改变了 HGP 的节奏与规则。公司方面拥有新式测序装备与装配算法，并一度拟将序列放入收费订阅数据库；公共联盟则依托百慕大原则每 24 小时公开倾倒数据——任何人都能免费获取最新序列，这在客观上削弱了商业数据库的独占价值。双方在 2000 年春天的合并谈判因数据释放政策分歧而未果，转而在 6 月 26 日以联合宣告收场。
这场竞赛的遗产有三。其一，公共计划的进度因竞争显著提前：草图从原设想的 2003 年提前到 2001 年。其二，“基因组序列属于公共品”由共同体惯例升格为国际规范。其三，分级与全基因组两条策略此后合流，成为后续测序时代 de novo 装配的标准组合。另有一个耐人寻味的细节：Celera 的论文发表时并未随文向 GenBank 提交序列数据，这在百慕大原则确立后的数据文化中格外醒目，并直接推动了此后期刊数据政策的讨论。
大事时间线（1985–2003）
- 1985.5Sinsheimer 在加州大学圣克鲁兹分校召集会议，首次将“测定人类全序列”作为工程议题论证；DOE 随后启动独立评估。
- 1988NRC 报告给出 15 年、约 30 亿美元的“先图后序”路线；NIH 设基因组研究办公室，Watson 出任首任主管；HUGO 成立。
- 1990.10HGP 正式启动，原定 2005 年完成；五年计划提出遗传图 2–5 cM 等阶段性目标。
- 1994–1996遗传图目标提前达成：Généthon 微卫星图密度由约 1 cM 推进到约 0.7 cM（Dib et al., 1996）；STS 物理图收录 15 086 个路标（Hudson et al., 1996）；1996 年百慕大会议确立数据共享原则。
- 1998.5Venter 与 PE Biosystems 合建 Celera，宣告以全基因组鸟枪法三年完成；公共联盟同年修订计划，目标改为 2001 年草图、2003 年完成。
- 2000.6.26克林顿在白宫宣布工作草图完成，Collins 与 Venter 同台，布莱尔卫星连线；竞赛转为合作姿态。
- 2001.2公共联盟草图发表于 Nature 409: 860–921；Celera 草图发表于 Science 291: 1304–1351，同月双论文互为对照。
- 2003.4HGP 宣告完成，较原计划提前两年；常染色质区覆盖约 99%、准确率 99.99%（完成图论文：Nature 431: 931–945，2004）。（后话：剩余异染色质约 8% 区段直至 2022 年 T2T-CHM13 才完全填补，Nurk et al., 2022。）
习题 1.4-2
全长约 6 kb、拷贝约 50 万的 LINE-1 元件，对 2001 年前后的 WGS 装配构成的威胁为什么远大于对分级路线的威胁？若可用的末端配对跨度为 2 kb 与 10 kb，能否跨越 LINE-1 全长？比 LINE-1 更长的着丝粒串联重复，为何两条路线都无能为力，又到何时才解决？
参考解答读长（不足 800 bp）远短于元件全长，来自不同 LINE-1 拷贝的读段彼此几乎不可区分：分级路线把装配限制在约 150 kb 的局部，每个拷贝两侧的唯一侧翼序列足以确定其归属，错误被限制在克隆之内；WGS 则必须依赖配对信息在支架层面跨越。2 kb 配对不能跨越 6 kb 的元件，10 kb 配对可以在支架层面跨越，但无法确定拷贝内部的精确组织。着丝粒区大规模串联重复的长度远超任何配对跨度，且几乎不含唯一锚点，两条路线都只能留缺口；直到长读长测序成熟后，2022 年 T2T-CHM13 才首次完整跨越这些区域。
1.4.4组织原则：百慕大原则、中心分工与工厂化科学
数据政策是 HGP 区别于以往任何生物学工程的组织特征。1996 年 2 月，主要测序中心的代表在百慕大会晤，确立了两条规则：长度不少于 1 kb 的人类基因组序列，应在产生后 24 小时内提交公共数据库；初级序列数据不申请专利。这一原则的背景与后果，见下方注记。
百慕大原则与数据共享 百慕大原则的思想先例来自线虫与人类基因组研究共同体的开放传统。其后果远超预期：GenBank 中的人类序列以“夜”为单位增长；加州大学圣克鲁兹分校为承载数据而开发的浏览器后来成为通用工具（见 1.6 节）；任何实验室——包括竞争对方——都能即刻取用最新数据。
由此，“开放数据”由共同体的美德升格为制度：2003 年的劳德代尔堡宣言与 2009 年的多伦多数据发布共识，把这一规范扩展到更广泛的“社区资源计划”。HGP 由此留下的不只是序列，还有一整套大型协作科学的数据伦理。
在执行层面，公共联盟把工作集中于大型测序中心，由中心按染色体区段认领任务。2001 年草图论文由约 20 个中心组成的联合体署名，其中五大中心（桑格、华盛顿大学圣路易斯、贝勒医学院、Whitehead/MIT、DOE 联合基因组研究所）承担了绝大部分产出（表 1.4-1，不完全列举）。
| 测序中心（国家/地区） | 在 HGP 中的主要角色 |
|---|---|
| 威康信托桑格研究所（英国，欣克斯顿） | 最大单一中心，贡献公共序列约三分之一；线虫基因组先导单位，1999 年完成首条完成级人类染色体（22 号） |
| 华盛顿大学基因组测序中心（美国，圣路易斯） | 人类序列主要产出中心之一；其团队与桑格共同完成线虫基因组（1998） |
| 贝勒医学院人类基因组测序中心（美国，休斯敦） | BAC 级大规模测序与完成图主力之一 |
| Whitehead 研究所 / MIT（美国，剑桥） | 美国境内产出最高的中心之一；2004 年与哈佛相关力量合组 Broad 研究所 |
| DOE 联合基因组研究所（JGI，美国） | 能源部系统多个国家实验室的整合体，承担 5、16、19 号等多条染色体区段 |
| Genoscope（法国，埃夫里） | 法国国家测序中心，牵头 14 号染色体等区段 |
| RIKEN（日本）与中国华大基因研究中心（中国） | RIKEN 与庆应大学完成 21 号染色体；华大（1999 年加入）承担 3 号染色体短臂部分区段，约 30 Mb、合全基因组约 1% |
这种组织方式被时人称为“工厂化科学”：测序从手艺变为工业流程——机器人挑克隆与点样、仪器 24 小时三班运转、实验室信息管理系统（LIMS）追踪每块板每条读段、统一的质量标准与集中式装配流水线；论文以机构联合体署名，个体贡献让位于工序分工。批评者以“大生物学”讥之，支持者则指出：正是这种可复制的工业组织，使测序成本持续大幅下降，并为后来的国际 HapMap、ENCODE 等计划提供了组织模板。
1.4.5ELSI：把伦理写进预算
HGP 是第一个在立项之初即为“反思自身”设立专项经费的大科学工程。NIH 与 DOE 分别将预算的至多 5% 与至少 3% 划给伦理、法律与社会影响研究(Ethical, Legal and Social Implications program, ELSI)；按 30 亿美元的总盘子计，其规模达上亿美元量级。这一安排与 Watson 的坚持直接相关：只测序列而不思考其社会后果，被视为对社会不负责任的科学。
ELSI 计划的议题与产出 ELSI 的议题清单包括：遗传检测中的知情同意与隐私——公共计划刻意采用多名匿名志愿者的混合样本建库，以降低身份回溯风险；基因专利的边界——1991–1992 年 NIH 的 EST 专利申请曾引发激烈争议，百慕大原则“初级序列不申请专利”的立场与之相互呼应，其后的疾病基因专利诉讼（如 BRCA1/2）延续了这一议题；遗传歧视——就业与健康保险中基于遗传信息的差别对待，直接推动美国 2008 年《遗传信息反歧视法》（GINA）立法；以及成果的公平可及与公众教育。
对 ELSI 的批评同样值得记录：有评论认为其经费规模与政策产出并不相称，且它在结构上始终从属于科学工程，并不拥有对计划本身的否决权——伦理研究是计划的“伴随项”而非“制衡项”。这一组织难题在今天的基因编辑与数据科学治理中依然存在。
1.4.6遗产与批评
HGP 的遗产首先是规范性的：24 小时数据公开由惯例变为行规，基因组坐标成为全学科的通用语言，围绕公共数据库生长出的浏览器与注释生态（见 1.6 节）重构了生物信息的组织方式。其次是技术性的：为 HGP 建立的测序工业与信息学平台，直接开启了成本持续下降的通道（图 1.4-2）。原书出版于 2009 年，当时单个人类基因组的测序成本已降至约 10 万美元量级（NHGRI 统计口径），较计划时期下降约三个数量级；此后仍在继续下降（超出本节叙述时点，仅作注记）。
对 HGP 的批评同样构成其历史的一部分。其一，经费挤出效应：在预算总量相对固定的条件下，大工程的巨额拨款被认为挤压了小实验室驱动的自由探索。其二，“序列不等于理解”：部件清单到手只是开始，操作手册的解读才刚起步——基因数仅约 2 万的结果，本身就是对线性“基因数决定复杂度”预期的一次谦卑教育。其三，医疗获益的兑现慢于立项宣传，从序列到药物与诊疗的路径比预想漫长。其四，专利与商业化摩擦持续存在，与数据开放原则反复角力。而为计划辩护的理由包括：模式生物基因组随同受益并反哺人类研究（见 1.5 节）；技术平台、人才与数据库的溢出效应深远；开放数据本身就是最大的公共品——正是它让批评者也得以用基因组数据展开研究。
概言之，HGP 留下了双重遗产：一份约 30 亿碱基的序列，以及一套“开放共享、国际分工、工厂化生产”的组织范式。分级与全基因组两条鸟枪路线在合流中延续至今。带着这套坐标系与组织经验，下一节转向与之并行的另一条战线——模式生物基因组计划。
习题 1.4-3
计算并讨论：(1) “每碱基一美元”的说法对应 HGP 预算 30 亿美元与 3.1 Gb 基因组之比；该口径忽略了预算中的哪些构成？(2) 2009 年单基因组成本约 10 万美元时，相当于每 Mb 多少美元？相对计划时期下降了多少倍？(3) 列举至少三个驱动成本下降的因素。
参考解答(1) 总预算还包括遗传图与物理图构建、模式生物基因组测序、数据库与信息学建设、ELSI 计划及技术研发，并非全部用于人类测序本身。(2) 100 000 美元 ÷ 3 000 Mb ≈ 33 美元/Mb，约为“1 美元/bp”（即 100 万美元/Mb）的三万分之一。(3) 毛细管电泳取代板状凝胶、机器人化与 24 小时运转的工厂流程、模板制备与试剂的微型化、竞争压力下的工艺改进，以及原书出版当年正处于起步期的新一代测序平台（因素不限于此三种）。
关键术语
- 人类基因组计划 (Human Genome Project, HGP)
- 1990 年启动、2003 年完成的国际工程，目标为测定并解析人类基因组全序列，预算约 30 亿美元、原定 15 年。
- 分级鸟枪法 (hierarchical shotgun sequencing)
- 先以重叠群物理图定位克隆、再逐克隆鸟枪测序的策略，长程顺序由图谱保证。
- 全基因组鸟枪法 (whole-genome shotgun, WGS)
- 跳过作图、直接对全基因组随机片段高冗余测序并整体装配的策略。
- 最小铺砌路径 (minimal tiling path)
- 重叠群中一列首尾搭接、以最小总冗余盖住目标区段的克隆序列。
- 末端配对 (mate-pair)
- 对同一克隆两端分别测序所得、跨度已知的一对读段，用于约束支架的顺序与方向。
- 支架 (scaffold)
- 由配对信息串联的重叠群集合，其间可含已知长度的缺口。
- 覆盖度 (coverage)
- 测序读段总长与目标长度之比；未覆盖概率随覆盖度按 e 的负指数下降（Lander–Waterman 模型）。
- 百慕大原则 (Bermuda Principles)
- 1996 年确立的数据规范：不少于 1 kb 的序列 24 小时内公开入库，初级序列不申请专利。
- ELSI 计划 (Ethical, Legal and Social Implications program)
- HGP 中占预算 3–5% 的伦理、法律与社会影响研究专项。
- 工厂化科学 (big biology)
- 以规模化、标准化、分工化方式组织的大科学模式，中心化设施与数据流水线为其特征。
参考文献与延伸阅读
- Gibson G, Muse SV. 2009. A Primer of Genome Science, 3rd ed. Sunderland (MA): Sinauer Associates. (Chapter 1)
- International Human Genome Sequencing Consortium. 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860–921.
- Venter JC, Adams MD, Myers EW, et al. 2001. The sequence of the human genome. Science 291: 1304–1351.
- International Human Genome Sequencing Consortium. 2004. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 431: 931–945.
- Collins FS, Morgan M, Patrinos A. 2003. The Human Genome Project: lessons from large-scale analysis of biology. Science 300: 286–290.
- Lander ES, Waterman MS. 1988. Genomic mapping by fingerprinting random clones: a mathematical analysis. Genomics 2: 231–239.
- Dib C, Fauré S, Fizames C, et al. 1996. A comprehensive genetic map of the human genome based on 5,264 microsatellites. Nature 380: 152–154.
- Hudson TJ, Stein LD, Gerety SS, et al. 1996. An STS-based map of the human genome. Science 272: 1942–1954.
- Adams MD, Celniker SE, Holt RA, et al. 2000. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science 287: 2185–2195.
- Nurk S, Koren S, Rhie A, et al. 2022. The complete sequence of a human genome. Science 376: 44–53.