3.1 基因组变异的类型

第三章导言提出了基因组科学的第二重维度：个体间差异。第二章建立的参考序列刻画的是「一个」人类基因组，而群体中任意两个无关个体的基因组并不相同——两条单体的序列平均每 1000 个碱基约有 1 处不同，全基因组累计达数百万处。这些可遗传的序列差异统称遗传变异(genetic variation)：它是自然选择的原料，是个体间性状差异的物质基础，也是本章后续各节一切方法——基因分型（3.2 节）、连锁不平衡（3.3 节）、QTL 作图与关联作图（3.4、3.5 节）——的操作对象。本节先解决分类学问题：变异从何而来，按形态与规模可分为哪几类，各类的生成机制与数量级如何。

3.1.1 变异的来源与命运

需要先区分两个层面的「来源」。减数分裂重组可以重排既有变异、生成新的等位基因组合，但它本身并不创造新序列；新序列来自三类过程：DNA 复制的差错、损伤修复（尤以双链断裂修复）的差错，以及转座因子(transposable elements)的插入（Gibson & Muse, 2009）。

第一类来源是复制错误。DNA 聚合酶本身并非完美的复制机器，其保真度由三道防线依次保证：聚合酶对正确底物的选择性、3′→5′ 校对外切活性对错误掺入碱基的切除、以及复制后的错配修复(mismatch repair)系统对残余错配的识别。三道防线对最终错误率的贡献可以粗略相乘：

第二类来源是双链断裂修复的差错，它比复制错误更能产生大片段变异。DNA 双链断裂有两条主要修复途径：非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)把两个断端直接连接，常在连接处留下小的插入或缺失；同源重组(homologous recombination)以姐妹染色单体为模板进行精确修复，但当修复导向错误模板——例如在两侧高度相似的重复序列之间错配（不等交换，或称非等位同源重组）——便会产生缺失与重复。人类基因组中的节段性重复(segmental duplications)（低拷贝重复）恰恰为这类错误提供了温床，使某些区段发生反复的、结构可预测的重排。分属两条染色体的断端被 NHEJ 错误连接，则产生易位。

第三类来源是转座因子的移动。人类长散在核元件 LINE-1（L1）编码逆转录转座所需的蛋白，既能自主移动，也能顺带动员非自主的 Alu 短散在元件；基因组中 L1 拷贝约 90 万条（约占序列 17%），Alu 拷贝逾 100 万个（约 10%），转座衍生序列合计约占人类基因组的一半。绝大多数拷贝已积累突变而失去活动能力，但少数「热点」元件至今仍有活性；新发 L1 或 Alu 插入一旦落在基因内部或调控区，可破坏基因功能——血友病等疾病由新发转座插入致病已有多例确证报告（Gibson & Muse, 2009）。转座插入因此同时是 indel 与结构变异（插入型）的重要来源。

新出现的变异起初必然稀少。它在群体中的走向属于「命运」问题：频率随世代如何变化由随机漂变与自然选择共同决定，此处仅给出分类学上必要的频率约定，机制留待 3.6 节展开。

3.1.2 单核苷酸多态（SNP）

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)指群体中频率不低于 1% 的单个碱基替换，是人类基因组中数目最多、研究最充分的一类变异。绝大多数 SNP 位点只有两个等位基因（双等位），三等位位点罕见——这与突变本身多以特定方向发生、且旧等位基因经漂变丢失有关。

按化学性质，碱基替换分为两类：转换(transition)是嘌呤与嘌呤（A↔G）或嘧啶与嘧啶（C↔T）之间的互换；颠换(transversion)是嘌呤与嘧啶之间的互换（A↔C、A↔T、G↔C、G↔T）。理论上颠换的可能组合是转换的两倍，但人类全基因组 SNP 中转换与颠换之比约为 2:1。这一偏倚的主要解释是胞嘧啶脱氨：未甲基化的胞嘧啶自发脱氨生成尿嘧啶，可被碱基切除修复识别清除；而甲基化的胞嘧啶（5-甲基胞嘧啶，多见于 CpG 二核苷酸）脱氨生成胸腺嘧啶，后者是「合法」碱基，不易被当作损伤修复，于是 C:G→T:A 的转换被系统性地固定下来。CpG 因此既是突变热点，又因长期流失而在基因组中显著低于随机期望（图 3.1-2A）。

就密度而言，任意两条人类单体型之间的差异约为 0.1%，即平均每 1000 bp 约 1 个差异；以 3.2×10⁹ bp 计，两个无关个体的一条同源染色体之间约有 300 万处不同。变异目录的建设即以此为基础：SNP 联盟与国际协作组于 2001 年发表了含 142 万个 SNP 的人类变异图谱（Sachidanandam et al., 2001）；千人基因组计划第一期（2010）将编目扩展到约 1500 万个 SNP、100 万个短 indel 与约 2 万个结构变异位点，且其中过半为此前未报道的新变异（The 1000 Genomes Project Consortium, 2010）；其后续阶段累计编目已超过 8800 万个变异（括注：2015 年数据）。总体格局是：频率达到「常见」程度的 SNP 以千万计，频率低于 1% 的罕见变异在数目上远超常见变异——这一常见与罕见的构成，直接关系到关联研究的统计功效（3.5 节）。

按位置与后果，落在编码区的 SNP（cSNP）可分为三类：替换不改变氨基酸的同义突变(synonymous substitution)（多位于密码子第三位的摆动位置）、改变一个氨基酸的错义突变(missense substitution)（按氨基酸性质替代的保守程度又分保守与激进），以及把编码氨基酸的密码子变为终止密码子的无义突变(nonsense substitution)。编码序列只占人类基因组的约 1.5%，故绝大多数 SNP 位于内含子、基因间区等非编码区，不改变蛋白序列——但如 3.1.5 节所述，「不改变蛋白」远不等于「没有效应」。

3.1.3 插入缺失（indel）与微卫星

插入缺失多态性(insertion/deletion polymorphism, indel)指序列中多出或少掉一小段（通常 1 至数十个碱基）的变异，习惯上将插入与缺失合称，因为群体数据中二者常难以在演化方向上区分。indel 的数目仅次于 SNP：千人基因组第一期编目的短 indel 即达约 100 万个（The 1000 Genomes Project Consortium, 2010）。其长度分布高度偏斜——长度为 1 bp 的事件最多，随长度增加频数急剧衰减（图 3.1-2B），数十 bp 以上的 indel 已属少数。

长度谱的形态直接指向其机制。短 indel 的主要来源是复制滑动(replication slippage)：在串联重复（尤其是单一碱基连成的同聚段，如 AAAAA）中，新生链与模板链短暂解离后再退火时容易错位一或数个单位，继续合成便在新生链上多出或少掉相应数目的重复单位。重复单位越长、重复拷贝越多，错位退火的机会越大，这解释了 1 bp 峰与同聚段语境的关联，也解释了下文微卫星的高突变率。较长的 indel 则更多来自双链断裂修复的加工（3.1.1 节）与转座插入。

当重复单位本身有序、且重复次数在个体间可变时，便得到一类特别的串联重复多态：微卫星(microsatellite)，又称短串联重复(short tandem repeat, STR)，由 1–6 bp 的单位（以 2–4 bp 最常见，如 CA）首尾相连构成；单位更长者称小卫星或可变数目串联重复（VNTR）。微卫星的突变同样以滑动为主，不等交换亦有贡献，其每代每位点突变率约为 10⁻⁴–10⁻³，比 SNP 位点高出三到五个数量级。高突变率带来高多态性：一个微卫星位点往往有十个以上的等位基因（多等位），杂合度常超过 0.7，单个位点的信息含量远高于双等位的 SNP。正因如此，微卫星在经典连锁分析中长期担任主力标记——1.2 节的遗传作图与法医 DNA 指纹分析均以之为栋梁。其代价同样明显：突变率高意味着家系内世代传递可能出现「新等位」，需要专门的遗传模型处理；位点在基因组中分布稀疏；逐一 PCR 扩增的分型方式难以规模化。因此在全基因组关联时代，微卫星让位于密集而稳定的 SNP 芯片（3.2 节），但在法医学与系谱鉴定中至今不可替代。

3.1.4 结构变异（SV）与拷贝数变异（CNV）

结构变异(structural variation, SV)指涉及较长片段（通常以 1 kb 至数 Mb 计）的基因组重排，按形态分为缺失、重复、倒位、易位与插入五类。其中缺失与重复改变所涉区段的拷贝数，合称拷贝数变异(copy number variation, CNV)，属「不平衡」变异；倒位与平衡易位不改变拷贝数，属「平衡」变异。二者的区分在检出与表型两个层面都有意义：平衡变异不改变基因剂量，效应往往更隐蔽，但断裂点若落在基因或调控区仍可致病。

结构变异的普遍性远超人们起初的预期。传统核型分析与染色体显带的分辨率止步于数 Mb，亚显微尺度的重排长期不可见；直至 2004 年，阵列比较基因组杂交技术才系统揭示全基因组范围内普遍存在的拷贝数多态（Iafrate et al., 2004）。2006 年发表的首张全基因组 CNV 图谱在 270 名 HapMap 个体中刻画了 1 447 个 CNV，覆盖约 360 Mb、约合基因组核苷酸的 12%（Redon et al., 2006）。综合 2007–2008 年间各家的估计，个体间拷贝数可变的区段所覆盖的核苷酸总量约为基因组的 10% 以上量级（应视为当时的估计：断点分辨率与参照集不同使各家出入较大，其后的高分辨率研究对覆盖比例有所下调，而长读长测序又在重复区段补充了新的变异；Feuk et al., 2006）。相当比例的 CNV 涉及基因乃至整个基因家族，对剂量敏感的性状可能产生可观效应。

检出何种变异，取决于采用何种手段。阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization, array-CGH)以样品与参照的杂交强度之比指示拷贝数的增减，是 CNV 发现时代的主力；SNP 芯片则同时利用等位基因信号与强度。基于测序的配对末端作图、读段深度与分裂读段能更精确地定位断裂点，并有能力发现平衡变异——这正是第二代测序时代结构变异检出的主线，其技术细节与 3.2 节的基因分型同源。平衡的倒位与易位在阵列上几近隐形，这是早期 CNV 图谱共同的盲区。

3.1.5 变异的表型效应谱

变异的形态分类之上还有效应分类。多数变异对适合度的影响微乎其微：编码序列只占基因组约 1.5%，部分替换又落在密码子的摆动位置；非编码区的多数差异既不改变调控也不改变结构。对这类中性或近中性变异而言，频率的世代变迁主要由随机漂变(genetic drift)支配——分子演化中性理论的核心论断（Kimura, 1968），其群体遗传机制在 3.6 节展开。

有效应的变异构成一个连续的谱。一端是调节性变异(regulatory variation)：落在启动子、增强子等顺式调控元件中，微调基因表达的水平、时序或组织特异性，效应通常温和而可累积——这是数量性状与适应性演化的重要分子基础。中间是编码区的错义与移码：效应取决于替换氨基酸的保守性与所在结构域。另一端是效应强烈的类型：无义突变与移码多导致功能丧失(loss of function)；部分变异使蛋白获得异常的新活性，为功能获得(gain of function)；拷贝数变异则常通过剂量敏感(dosage sensitivity)起效——基因单份拷贝不足（单倍剂量不足）或三份拷贝过量皆可致病，这正是 3.1.4 节 CNV 的医学意义所在。

基因型与表型的对应还须由两个概念加以限定。外显率(penetrance)指携带某基因型的个体中实际表现相应表型的比例：外显率 100% 为完全外显，不足者为不完全外显——例如携带 BRCA1 病理性变异者终生患乳腺癌的风险约为一半以上而非必然。表现度(expressivity)指同一基因型在不同携带者间表型严重程度的变化：同一家系内携带相同神经纤维瘤病 I 型变异的成员，症状轻重可相差悬殊。修饰基因、遗传背景与环境共同造成二者，它们是解读任何基因检测报告时必须携带的限定词。

由效应谱可以预读疾病遗传架构的两种形态。单基因（孟德尔）病的致病变异通常稀有而高外显，效应强到足以在家系中勾勒出清晰的传递模式；复杂疾病（糖尿病、高血压、常见肿瘤等）则更多由常见而低外显的微效变异叠加环境构成，单个变异既非充分亦非必要。这两种架构对研究设计的要求截然不同——家系连锁（3.4 节）与群体关联（3.5 节）各擅其一，临床与伦理含义亦有差别（3.7 节）。

3.1.6 变异目录资源：dbSNP 与 DGV

变异研究的第一份基础设施是公共目录。dbSNP(database of single nucleotide polymorphisms)由美国国家生物技术信息中心（NCBI）与国家人类基因组研究所（NHGRI）协作建立（Sherry et al., 2001），是人类变异的最大集散地。dbSNP 以 rs 编号(reference SNP accession number)组织条目：不同研究者提交的、经聚类认定指向同一变异的记录归并为一个 rs 号（如 rs334），随附侧翼序列、验证状态与各群体频率。今天 dbSNP 收录的条目已达数亿量级，其中绝大多数是罕见变异——「S」开头的名字早已名不副实，它实际是全谱系的变异目录（临床意义层面的解读另有 ClinVar 等资源，括注：建于原书出版之后）。

结构变异的对应设施是基因组变异数据库(Database of Genomic Variants, DGV)（Zhang et al., 2006）：它以人工审编的方式汇总经同行评议报告的人类生殖系结构变异，提供经过整合的坐标与基因注释，是 CNV/SV 研究的标准参照。dbSNP 与 DGV 一小一大、一序列一结构，共同构成变异世界的「户口系统」。