7.1 定量氢谱的原理与条件

本章先讨论定量原理，再分别展开标准选择、不确定度、混合物和研究应用。BIPM 的 qNMR 计划和内部标准资料强调测量设计、参考物质与可追溯性；Duewer 等（2023）的 IUPAC 技术报告把 qNMR 与其他纯度赋值方法放在共同的计量框架内。这里先用理想模型建立面积比，再明确实际测量需要检验哪些条件。

对组分 \(i\) 的一个完整报告信号，设其积分为 \(I_i\)，每分子贡献的相应氢数为 \(N_i\)，物质的量为 \(n_i\)。在可比响应成立时，可写 \(I_i=K N_i n_i\)。\(K\) 汇集当前实验的共同响应与尺度，积分通常采用任意面积单位。\(N_i\) 只计该区域每分子贡献的氢；多重峰的各条谱线共同组成一个完整报告信号。

A 为待测物，S 为参照物。二者在同一均匀溶液、同一采集与处理流程中具有可比响应时，共同常数可约去。这个关系先给物质的量比；若要得到质量比，需要再乘相应摩尔质量。用一个三氢甲基与一个两氢亚甲基比较，必须分别除以三和二，不能直接把原始面积比称为浓度比。

先采用一个明确的简化模型：理想 90° 激发，每次激发后纵向磁化归零，横向相干在下次激发前不再产生额外贡献，核之间无需考虑复杂耦合弛豫。设相邻激发之间的时间为 \(T_R\)，则激发前磁化相对平衡值的恢复分数为：

\(T_R\) 与 \(T_{1,i}\) 使用相同时间单位。简单延迟—脉冲—采集实验中，重复时间包含弛豫延迟、采集时间及其他实际开销，不能把仪器显示的某一个延迟参数自动当成全部重复时间。复杂脉冲序列会改变恢复与转移，使用公式前要检查模型是否适用。

教学例：两报告核有相同的真实 \(N_i n_i\)，但 \(T_{1,A}=1.0\ \mathrm{s}\)，\(T_{1,S}=4.0\ \mathrm{s}\)。在 \(T_R=2.0\ \mathrm{s}\) 时，A 恢复约 0.8647，S 只恢复约 0.3935，面积归一比变成约 2.197。真实比例为一，按充分弛豫公式计算却会得到约 119.7% 的正偏差。这种差异不会因为把谱图画得更平滑而消失。

若把重复时间增至 20 s，最长 \(T_1\) 的核恢复到 \(1-e^{-5}\approx99.326\%\)，另一核几乎完全恢复，比例偏差仍约 0.678%。因此常见的“五倍最长 \(T_1\)”只是一个具有已知残留饱和量的设计起点，是否够用取决于目标误差和两个信号的响应差。高精度测量须测定相关核的实际 \(T_1\)，或通过延长时间系列验证比例已稳定。

弛豫参数还应在实际定量样品和相应条件下检查。溶剂、浓度、温度、溶解氧和顺磁杂质都可能影响恢复，纯参照溶液中的数值未必可直接用于含待测物的混合溶液。最长值应覆盖参照与全部选定报告信号，不能仅测最容易观察的待测峰。若只在原有条件上增加一个延迟参数，还需核对其他参数是否同时改变，保证比例比较确实针对恢复时间。

一个处理明确的时间系列可以把积分比作为重复时间的函数记录。短时间段有明显变化、长时间段逐渐稳定，支持饱和影响得到控制；若始终变化或出现不一致的峰组，可能还存在交换、漂移或样品变化。稳定平台的判据应结合噪声和目标误差设定，不能只凭相邻两次显示相同的两位小数结束检查。精度较差时，平台可能只是显示分辨率不足造成的假象。

较小翻转角可以改变重复实验的饱和与时间效率，但不保证短重复时间下的面积比例自动正确。其稳态纵向磁化与前一次脉冲仍有关，不同 \(T_1\) 的差异必须纳入设计。不能把 90° 模型的恢复公式直接套到任意翻转角；也不能只因常规结构实验使用 30°，就将其默认参数视为完成验证的 qNMR 条件。

质子去耦、弛豫过滤和扩散过滤同样可能改变响应。它们能使复杂样品中某些信号更易观察，但不同组分被衰减的程度可能不同。第7.6节将讨论扩散与混合物；此处先记住经过过滤的积分须用相应模型或校准解释。增强可见性与保存原始物质的量比例是两项需要分别检查的性能。

选择报告信号时，优先考虑已指认、完整、无明显重叠且条件稳定的区域。可交换 OH、NH 的面积常受交换及抑制影响，通常需要额外验证。若候选核的完整多重峰跨过杂质，不能只挑其中一条最干净谱线后继续使用整个氢数，除非建立并验证该分量与总信号的关系。

峰高随线宽变化，面积在合适条件下才与核数成比例。相同面积的宽峰可能比窄峰低得多，不能用最高点直接比较物质的量。积分区间应覆盖整个相关多重峰及适当尾部，同时处理邻近峰和卫星的影响。不同信号采用不一致的截取规则，会使面积比例依赖人为选择。

相位、基线和数字分辨率会直接影响面积。一个很小的基线偏移在较宽积分区间内累积成明显误差；峰重叠则可能让污染面积进入目标。加窗和零填充可以改变呈现，但不会凭空增加独立观测。处理参数应保留并用于全部样品，检查合理改变积分边界或基线模型时结果是否稳定。

若用峰拟合分开重叠信号，结果依赖峰形、峰数和背景模型。应检查残差、可辨识性及已知比例样品，不能只因拟合曲线光滑就认定面积正确。两个严重重叠成分可能在总曲线相似的情况下获得不同面积分配。定量任务中这种模型歧义需要进入方法验证与不确定度，而不是隐藏在软件导出的最后一列。

检查线性时，可在目标范围内制备不同已知比例的混合物，比较面积归一比与物质的量比是否相容。两端的数据尤其有用：高浓度端可暴露接收或溶解问题，低浓度端可暴露噪声、基线与杂质贡献。若只测一个接近一比一的样品，局部相容不能说明很低含量的组分也能准确测量。参照量过多或过少，都可能使另一信号的处理成为限制。

教学算例沿用图 7.1-3：待测三氢信号面积六，参照两氢信号面积二，参照为 1.00 mmol，计算待测为 2.00 mmol。若待测区误包含面积 0.30 的杂质而参照不变，则得到 2.10 mmol，产生 5% 正偏差。增加扫描次数会更清楚地重现这份污染面积，仍不能降低这项偏差。

质量分数定量还需要可靠称量和参考物质纯度。溶液浓度则要考虑体积定义及温度等因素；若只报告相对摩尔比例，两组分共同的体积可约去。没有被检测到的水、无氢杂质或其他组分也可能进入总样品质量，所以把所有可见积分归一化到一百，不会自动得到真实质量纯度。

一个可复核结果应包含被测量定义、样品与参照的身份和制备、报告信号及氢数、主要采集和处理条件、计算方式与不确定度。Oxford NMR Facility 的方法手册可帮助理解实验步骤，具体仪器命令仍须按当地平台确认。下一节将详细讨论内标、外标和样品制备，把本节的已知参照物质的量落实到可追溯的实际测量。