1.1 转录与翻译之间：为什么需要直接测量蛋白

1.1.1 中心法则的方向性

分子生物学的中心法则(central dogma)讨论序列信息在分子之间的传递。对蛋白编码基因，常见过程是 DNA 转录为 RNA，再以 mRNA 为模板翻译为蛋白。中心法则的核心限制是序列信息不能从蛋白传回核酸或蛋白，并非所有信息传递都只能沿这一条路径发生（Crick, 1970）。它描述序列关系，却不规定 mRNA 与蛋白分子数之间的比例。

mRNA 与蛋白测量提供的信息因而不同。mRNA 丰度反映转录与 RNA 降解共同作用后的结果；蛋白丰度及其修饰、定位和结合状态，则与催化、转运、信号传导和结构支撑等功能密切相关。测量对象应与生物学问题匹配：分析转录响应时，RNA 是直接的研究对象；分析蛋白数量与功能状态时，还需要蛋白层面的证据。即使测得总蛋白丰度，也不能直接据此断定酶活性或通路活性。

本书以蛋白组(proteome)为研究对象，即一个细胞在给定时刻具有的全部蛋白。蛋白组研究还关注各蛋白的丰度、修饰与相互作用。系统测定并比较蛋白组的学科称为蛋白组学(proteomics)，主要检测手段是质谱与基于亲和试剂的方法。

1.1.2 mRNA 能解释多少蛋白丰度

蛋白丰度能否由 mRNA 推算，可以通过配对定量检验。自 2000 年代中期以来，酵母、小鼠与人的大规模研究逐步提供了这类数据；部分早期跨基因测量得到约 0.4–0.6 的相关系数（Vogel and Marcotte, 2012）。在人细胞系的一项分析中，mRNA 浓度单独解释约四成的蛋白丰度变异，加入序列特征后，模型解释比例升至约三分之二（Vogel et al., 2010）。这些结果依赖所测基因、实验条件与建模方法，不宜当作所有细胞的固定参数。

解释相关系数时，首先要明确统计对象。跨基因比较中的皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient)度量同一条件下各基因的 mRNA 与蛋白丰度是否线性共变。在含截距的一元线性回归中，决定系数(coefficient of determination)等于 r²，表示该模型解释的样本方差比例：

因此，r ≈ 0.5、r² ≈ 0.25 表明这类线性模型仍有较大的未解释变异，并不表示四分之三的蛋白丰度方差在生物学上与 mRNA 无关。图 1.1-1 用示意散点说明：即使 mRNA 丰度相近，不同基因的蛋白丰度也可能有较大差异。

功能类别与预测范围

不同功能类别的基因也可能具有不同的 mRNA–蛋白关系。核糖体蛋白等翻译相关组分参与具有化学计量约束的复合物，其表达常较协调；信号分子、膜受体与分泌蛋白还受多种转录后过程调节（Vogel and Marcotte, 2012）。分析时应检查目标基因所属类别，而不是假定所有基因都遵循同一条回归关系。

mRNA 谱仍可为细胞类型归类和通路层面的转录响应提供信息，但这与精确预测某个蛋白的数量或修饰状态是不同任务。跨基因的 r ≈ 0.5 也不能直接描述某一个基因在不同时间或不同细胞中的预测表现；后者需要相应的配对数据单独检验。

1.1.3 稳态模型：翻译与降解如何影响蛋白量

翻译合成与降解清除可以解释 mRNA–蛋白比例为何变化。最简的一级动力学模型假定合成通量正比于 mRNA 数量，降解通量正比于现有蛋白数量，并暂不计细胞分裂带来的稀释。设某基因的 mRNA 分子数为 M，蛋白分子数为 P，则

式中的第一个参数是翻译效率(translational efficiency)，在本模型中表示每条 mRNA 单位时间产出的蛋白数。不同基因之间可相差百倍，密码子使用、非翻译区结构、microRNA 与 RNA 结合蛋白等均可能参与调节。第二个参数是蛋白降解速率常数；对应的蛋白半衰期可从几分钟到几天不等，泛素–蛋白酶体与自噬等途径对不同底物具有选择性。稳态下，两者的比值决定蛋白与 mRNA 的拷贝数比，因而可形成数百倍、接近三个数量级的跨基因差异（Schwanhäusser et al., 2011）。

求取式 (1.1-2) 的稳态解，还要求 M 与两个速率常数在相应时间尺度上近似不变，且系统有足够时间接近稳态。即便准确测得 M，也仍需给定翻译和降解参数；这些参数又会随应激、分化与细胞周期而变化。细胞正在快速响应刺激时，稳态关系可能不适用。下面的演示固定这些假设，拖动任一滑块即可按式 (1.1-2) 重新计算。

1.1.4 时间尺度：蛋白是转录波动的低通滤波器

mRNA 与蛋白还具有不同的时间响应。细菌 mRNA 的半衰期(half-life)常以分钟计；哺乳动物细胞的研究中，中位估计约为 5–10 小时。蛋白半衰期的范围更广，可从某些受严格调控的信号分子的几分钟，延伸至组蛋白、骨架成分的数天；群体研究的中位估计常以十小时计。这些是特定系统中的量级，不能理解为每一种蛋白都比其 mRNA 更稳定。一级动力学下，半衰期与速率常数可互相换算：

这种时间尺度差异有助于理解单细胞内的波动。许多真核基因表现出转录爆发(transcriptional bursting)：启动子在活跃与沉默状态间随机切换，mRNA 合成呈脉冲状，两次脉冲的间隔可达小时（Raj et al., 2006）。若蛋白的寿命明显长于转录波动的时间尺度，早先合成的蛋白在脉冲间歇期仍可保留。蛋白量因而反映过去翻译通量经降解加权后的累积结果，对快速波动的相对响应较小，且常滞后于 mRNA。这一性质称为低通滤波(low-pass filtering)，见图 1.1-2。

因此，比较 mRNA 谱与蛋白谱时，还需考虑采样时刻。对依赖新转录和翻译的刺激响应，mRNA 变化可以先于蛋白丰度变化，两者的幅值之比随时间改变；在昼夜节律、细胞周期等周期性系统中，两者也可能存在相位差（Liu et al., 2016）。单个时刻的转录组不足以确定同一时刻的蛋白状态，时间序列测量有助于区分这些过程。

表 1.1-1 对照两类测量所提供的信息及其常见量级。

1.1.5 只在蛋白层面可见的信息

即使 mRNA 与蛋白丰度同步变化，转录组也不能直接给出蛋白的修饰状态。翻译后修饰(post-translational modification, PTM)包括磷酸化、泛素化、乙酰化和糖基化等对蛋白的化学修饰。其中，磷酸化(phosphorylation)可在总蛋白数量基本不变时，调节蛋白活性、定位或结合关系。

磷酸化：分子数不变，活性改变

Ras–Raf–MEK–ERK 信号级联说明了这种区别。生长因子刺激后，ERK 的磷酸化水平可在几分钟内升高并随后回落，而 ERK 总量在此期间几乎不变。mRNA 丰度或总蛋白丰度测量难以分辨这类响应，需要检测磷酸化状态或相应活性，才能分析信号传导的时间过程。

剪切激活与复合物组装

另外两类过程也可以不依赖即时的新转录。其一是酶原(zymogen)激活：消化酶与凝血级联中的许多因子以无活性的前体形式存在，经特定剪切后获得活性，这一步无需重新合成整条蛋白。其二是复合物组装：代谢酶的多聚化、转录因子与辅助因子的结合都会影响功能。组成亚基的数量并不直接等于已组装且具有活性的复合物数量。

测量这些属性，需要根据靶标选择检测方式。亲和法通过抗体识别蛋白表位：CITE-seq 在同一细胞中结合抗体标记与转录组测序（Stoeckius et al., 2017）；质谱流式（CyTOF）借助金属标签抗体一次测数十个参数（Bendall et al., 2011），但靶标须预先选定。非靶向质谱则可在不预选全部靶标的条件下测量较广的蛋白集合；SCoPE2 的研究在单细胞数据集中合计定量了数千种蛋白，单个细胞通常约千种（Specht et al., 2021）。总蛋白定量并不自动覆盖所有修饰与相互作用，后者还需专门的实验设计。两条路线的原理与适用条件见 1.3 节。

1.1.6 从蛋白测量到单细胞测量

确定蛋白状态，需要同时考虑数量、时间和分子形式。转录组能为这些问题提供线索，但单凭 mRNA 丰度，无法确定给定条件下的翻译与降解参数，也不能直接识别修饰和组装状态。直接测量蛋白因此是研究这些问题的重要证据；具体采用总量、修饰还是活性检测，应由研究问题决定。

进一步研究细胞间差异时，还需要保留单个细胞的信息。上文部分丰度与半衰期估计来自群体测量；例如，将百万个细胞混合后测量，所得平均值不能区分各细胞的不同状态。合成与降解的随机性、转录爆发及细胞状态差异，都可能导致同类细胞甚至姊妹细胞具有不同的蛋白组。下一节将讨论群体均值如何掩盖这种异质性，以及为什么需要单细胞测量。相关实验与报告规范见 Gatto et al.（2023）。

设计后续实验时，可依次检查以下条件：

• 测量对象：问题涉及转录本、总蛋白、修饰还是活性，所选检测是否直接覆盖该属性；
• 统计范围：引用 r ≈ 0.4–0.6 时，是否交代数据处理与比较对象；在上述线性回归设定下，该区间上端对应的 r² 约为 0.36，不代表普遍上限；
• 动力学条件：是否接近稳态，k_tsl 与 k_deg 能否视为常数，以及采样时间是否足以区分合成与降解；
• 细胞差异：群体平均是否足以回答问题，还是需要直接比较各细胞的蛋白状态。