1.2 均值的假象：细胞异质性与单细胞分辨率

1.2.1 整体测量读的是什么：一个加权平均

把一管细胞裂解、酶解、进质谱，得到的定量值常被当作"这管细胞的蛋白丰度"。严格说，它只是整体测量(bulk measurement)的一个数字：一管裂解液里混着成千上万万个细胞，仪器的每一次读数都是这些细胞各自含量的加权平均。设样品里有 N 个细胞，第 i 个细胞中蛋白 P 的真实量为 x_i，则整体读数

权重 w_i 本身也有内容。一个哺乳动物细胞约含 100–200 pg 蛋白，而体积与蛋白含量随细胞周期、类型与状态可以相差数倍：G2 期的细胞比 G1 期大出一圈，巨噬细胞比淋巴细胞重得多。体积大、蛋白多的细胞在裂解液里贡献更多肽段，在式 (1.2-1) 中的权重相应更大——所谓"一管细胞的蛋白组"，严格说是"按蛋白含量加权的蛋白组"。比较两个组成不同的群体时，这份权重偏倚一并掺在均值里。

这个公式平淡无奇，却是本节全部麻烦的来源。求和是一种有损压缩：N 个数坍缩成 1 个数，分布的形状——有几个峰、峰在哪里、各占多少——在求和过程中全部丢失。两个截然不同的群体可以给出同一个均值：一种是"所有细胞都表达 55"，另一种是"一半细胞表达 100、一半表达 10"，二者的整体读数完全相同，任何整体层面的实验都无法区分这两种世界。细胞的细胞异质性(cellular heterogeneity)——基因型相同的细胞之间在分子状态上的系统差异——恰恰藏在这被减掉的信息里（Altschuler and Wu, 2010）。

整体测量还有一个常被误读的优点：技术重复之间高度一致。这种一致性不是测得准的证据，而是平均掉的必然结果。若单细胞间真实变异的标准差为 σ，则 N 个细胞混合物的均值标准差按 σ/√N 缩小：

1.2.2 均值落在无人区：一个可以算穿的反例

抽象地说"均值丢失分布"缺乏冲击力，值得用一个能算到底的例子。设某群体由两种状态组成：A 态细胞中蛋白 P 的表达量为 100（任意单位），B 态细胞中为 10，两种状态各占一半。按式 (1.2-1) 取等权，整体读数为

55 这个数字有什么问题？问题是：群体里没有任何一个细胞表达 55。每个细胞要么在 100 附近，要么在 10 附近，均值落在两峰之间密度几乎为零的"无人区"。以 55 为中心去检索细胞、设计引物、挑选标志物，会一无所获——它是一个只存在于求和公式里的数，不对应任何生物学实体。图 1.2-1 画出了这个处境。

还须澄清一个容易混淆的辩护：整体测量并非只有均值，生物学重复之间的方差也在测量之列。但由式 (1.2-2)，重复间方差只反映抽样波动，随混合细胞数增大而缩小；它测的是"这管与那管差多少"，不是"这个细胞与那个细胞差多少"。单细胞之间真实的变异——异质性本身——在整体数据里没有任何对应的统计量。

1.2.3 亚群各自变化而均值不动：辛普森式抵消

"无人区"还是静态的假象，动态情形更有欺骗性。统计学里有一条著名的警告：分组趋势与合并趋势可以方向相反，即辛普森悖论(Simpson's paradox)。它在药理实验中的蛋白组学版本是：药物让每一个亚群都下调了目标蛋白，整体读数却纹丝不动。

构造一组具体数字。对照样品中，耐药样的 A 态细胞占 30%，蛋白 P 表达 100；敏感的 B 态占 70%，表达 50。整体读数 = 0.3×100 + 0.7×50 = 65。给药之后发生两件事：其一，药物在细胞层面抑制 P 的合成，两态各自下调——A 态降到 85（下调 15%），B 态降到 35（下调 30%）；其二，药物同时杀伤敏感的 B 态，群体组成漂移，A 态占比升到 60%。处理样品的整体读数 = 0.6×85 + 0.4×35 = 65。前后完全相同。如果只看整体数据，结论是"药物对蛋白 P 无影响"——而事实上没有任何一个细胞的 P 保持不变。

把这件事写成一般形式就看清了。设亚群 g 的占比为 p_g、均值为 m_g，处理前后整体均值的变化可以精确分解为

图 1.2-2 把这组数字画成对照图。三个柱组里，两个亚群的均值都实实在在下降了，唯独最右侧的合并读数不动。这不是统计误差，也不是测量失误，而是求和的结构性质：只要亚群均值与亚群占比同时变化，整体读数就可以给出任何方向、任何大小的"结果"，包括零。

反过来同样成立：两亚群的蛋白什么都没变，只因占比漂移，整体读数就能"看出"一场轰轰烈烈的变化。仍用同一组基数：A 态 100、B 态 50，若给药后两态细胞内的表达量分毫未动，只是耐药的 A 态占比从 30% 升到 60%，整体读数就从 65 升到 0.6×100 + 0.4×50 = 80，涨幅约 23%——一份"没有任何细胞变化"的生物学，被汇总成了接近四分之一的显著上调。按式 (1.2-4)，此时第一项与第三项为零，全部读数变化都来自第二项的组成效应。

肿瘤治疗、免疫激活、分化诱导都会剧烈改变细胞组成，凡是比较处理与对照的整体蛋白组，都在式 (1.2-4) 的三项纠缠里下注。单细胞分辨率的直接收益，就是把 p_g 与 m_g 拆开分别估计，让"细胞变了"与"细胞比例变了"各归其位。

1.2.4 异质性的三个层次：类型、状态、噪声

"细胞不一样"是一句过分笼统的话。按来源与时间尺度，异质性至少分三个层次，它们对测量分辨率的要求并不相同。

第一层是细胞类型(cell type)：T 淋巴细胞与巨噬细胞之别，由谱系决定，稳定存在。类型间的分子差异大，marker 明确，流式分选或激光显微切割可以把类型拆开再整体测量——所谓细胞富集的思路。困难在于预设的 marker 未必覆盖全部类型，富集本身也会引入偏倚。

第二层是细胞状态(cell state)：同一类型内的激活、耗竭、分化过渡、耐药应激等，由信号通路与微环境驱动，可以相互转换。状态没有干净的边界，常常排成一条连续的谱，也没有公认的 marker 组合可以事先富集。上一小节的辛普森式抵消，最常发生在这一层：药物改变的首要对象往往就是状态分布。

第三层是随机波动：基因型相同、环境相同的细胞之间仍然存在的分子量差异，来自转录爆发(transcriptional bursting)——基因按启停节律零星转录，而非匀速表达——以及翻译速率、降解速率的内生噪声。蛋白的寿命普遍长于 mRNA，噪声在蛋白层面被低通滤波，但绝不会归零（Altschuler and Wu, 2010）。这一层原则上无法靠富集消除，只能在单细胞数据里作为分布来刻画。

层次与测量单元的匹配还有一个容易被忽略的方向：处理因素本身常常同时作用于几个层次。免疫刺激既改变单个细胞的基因表达（状态层），也改变细胞组成（类型层）——仅 CD4 与 CD8 T 细胞比例的漂移就足以推动整体读数，而不需要任何一个细胞改变表达。实验设计若不预先记录组成信息，事后无法从整体数据里把两层分开；这正是流式细胞术长期承担计数职责、并与整体组学并用的原因。

层次越高（越接近随机波动），需要的测量颗粒度越细。反过来说，一个生物学问题落在哪一层，决定了它是否必须动用单细胞技术：比较两种组织的细胞类型构成，单细胞并非唯一出路；追问状态转换的路径与噪声的幅度，则没有别的选项（Shapiro et al., 2013）。

1.2.5 单细胞分辨率买到了什么

把测量单元从一管细胞换成单个细胞，收益集中在三件事上，每一件都有整体方法无法替代的论证。

发现稀有亚群

一个占比为 p 的稀有亚群(rare subpopulation)对整体均值的贡献被稀释 p 倍：占比 0.5% 的耐药前体即使把某个蛋白表达抬高百倍，整体读数的移动也可能淹没在批次噪声里。单细胞测量里它不是被稀释的份额，而是数据表里实实在在的一小簇点——检出阈值从"对均值的贡献"换成了"有没有这么几个细胞"，两者相差可达几个数量级。肿瘤中的耐药前体、造血里的静息干细胞，都属于只有换算成"以细胞为单位"才可见的对象。

刻画状态连续谱

分化与重编程不是开关，而是细胞沿连续状态空间的移动。Bendall 等以金属元素标记抗体的质量细胞术（CyTOF）一次测量人类造血样品的 34 个参数（31 种抗体，加 DNA 含量、活性与事件长度），看到的是铺满标记物空间的连续分布，而不是教科书式的离散分支；药物响应也随细胞在谱上的位置连续变化（Bendall et al., 2011）。这类结构在整体数据里没有对应物——均值不随"谱"定义。单细胞转录组同样由此发端：Tang 等对单个小鼠卵裂球的测序检出的基因数比微阵列方法多约四分之三（Tang et al., 2009），第一次把一个细胞当作完整的测量对象。

避免伪差异与伪无差异

1.2.3 节的抵消是伪无差异；镜像情形同样常见：两个亚群一升一降，整体读数显示净变化，把方向相反的两件事汇报成一件。单细胞数据按群分层估计后，两种伪象同时消失。

收益要有兑现条件。单细胞分辨率的统计力量取决于测了多少个细胞：检出占比 p 的亚群，期望需要约 3/p 个细胞才有把握碰到数个成员；刻画分布形状要的更多。因此单细胞实验的报告须交代细胞数、通量与缺失情况（Gatto et al., 2023）——"单细胞"三个字本身不是证据，数字才是。收益也标着价签：单个细胞只提供约百皮克蛋白，样品量比常规微克级制备少约三个数量级，缺失值、通量与定量动态范围都要付出代价；这些代价与两条技术路线各自的对策，是 1.3 节及后续各章的主题。

1.2.6 为什么必须在蛋白层面看

上一节确立了"以细胞为单位"；本节回答"为什么测蛋白"。单细胞转录组（Tang et al., 2009）先行十余年，工具成熟、通量极高，但细胞的当下状态恰恰是蛋白层面的属性，有三条独立的理由。

其一，状态的执行者是蛋白。细胞对药物、细胞因子、应激的应答由信号通路驱动，通路的活动水平表现为磷酸化(phosphorylation)等翻译后修饰(post-translational modification)的动态组合。修饰不编码在核酸序列里，mRNA 测量原则上不可见；磷酸化谱型是状态转换最直接的读数，也是耐药、激活、分化这些状态标志的所在层次。

其二，蛋白丰度与 mRNA 丰度只部分耦合。1.1 节已讨论转录与翻译之间的定量缺口：蛋白的寿命、翻译效率与降解调控使 mRNA 相同的细胞可以持有不同的蛋白组。状态转换尤其如此——转换由既有蛋白的修饰与互作启动，早于新转录本出现；蛋白的半衰期又让历史状态在蛋白层面留下痕迹。要看的正是这些 mRNA 追不上的时间。

其三，蛋白测量与蛋白功能直接对表。酶活性、受体占用、转录因子的占位状态，都由蛋白及其修饰承载；单细胞蛋白数据与表型之间的因果链最短。亲和与质谱两条技术路线（1.3 节展开）由此分工：CyTOF 一类的金属标记抗体方法以适中的蛋白数换取极高的细胞通量与稀有色群检出（Bendall et al., 2011）；CITE-seq 用抗体衍生标签在测序平台上同时读转录本与表面蛋白（Stoeckius et al., 2017）；基于质谱的路线则无偏向地定量上千种蛋白——SCoPE-MS 首次在单个人类细胞中定量逾千种蛋白，揭示分化中的蛋白组异质性（Budnik et al., 2018），SCoPE2 进而以 3,042 种蛋白刻画 1,490 个单核/巨噬细胞的异质性（Specht et al., 2021）。

于是本节的全部分析汇聚成一句话：均值掩盖异质性，而异质性在蛋白层面表达为功能状态。把这两件事同时解决——既以细胞为单位，又在蛋白层面读状态——正是后续各章技术展开的立足点。

本节的核心论证可以压成三条，后续章节的技术讨论将以它们为前提：

• 整体读数是加权平均（式 1.2-1），分布形状与亚群结构在求和中不可逆地丢失，均值可以落在没有任何细胞存在的区域；
• 亚群均值与群体组成同时变化时，整体差异可被完全抵消或凭空制造（式 1.2-4），细胞状态与随机噪声两层异质性对整体测量不可见；
• 单细胞分辨率把"细胞变了"与"细胞比例变了"拆开估计，而状态标志——磷酸化等翻译后修饰——只在蛋白层面可读，这构成单细胞蛋白组学的双重动机。