2.1 皮克级样品：单细胞样品制备的物理化学

摘要　单个哺乳动物细胞约含 100–200 pg 蛋白，样品制备中的吸附、转移和污染因此会显著影响测量。本节先换算质量与分子数，再用表面容量和多步回收模型说明损失如何累积，并以泊松模型分析低离子数采样的一种限制。在明确这些模型的适用条件后，讨论缩小体积、减少转移、控制背景与优化酶解的依据。

2.1.1 样品量：皮克、飞摩尔与阿摩尔

质谱路线的实验设计首先需要明确可用的样品量。一个哺乳动物细胞约含 100–200 pg 蛋白（Zhu et al., 2018a）。以常规微量流程的 1 µg 起始量为例，与 200 pg 相比相差约五千倍，超过三个数量级；1 µg 是这里的比较基准，并非所有常规实验的统一要求。若器壁吸附或试剂背景带来的绝对量没有随起始量同步降低，其占比就会显著增加。

换算为分子数，可以进一步估计每种蛋白的可用量。质量 m、摩尔质量 M 与分子数 N 之间满足

\[n = m / M \quad N = n \cdot N_{A} \quad N_{A} \approx 6.02 \times 10^{23} mol^{-1}\]

(2.1-1)n 为物质的量，N_A 为阿伏伽德罗常数。以 100 pg 总蛋白、平均摩尔质量 50 kDa 计：n = 1×10⁻¹⁰ g ÷ 5×10⁴ g/mol = 2×10⁻¹⁵ mol ≈ 2 fmol；N ≈ 1.2×10⁹。

按上述假设，一个细胞含约 10⁹ 个蛋白分子，分布于数千种蛋白。某种 50 kDa 蛋白若每细胞有 2.4×10⁷ 个拷贝，其质量约为 2×10⁻¹² g（2 pg），物质的量为 40 amol。总蛋白为 fmol 量级，单种蛋白却可能仅有 amol 或 zmol 量级：每细胞一万拷贝的蛋白约为 17 zmol。评价回收率和背景时，既要关注总量，也要考虑低拷贝蛋白的可用分子数。

这里必须区分固定比例损失与固定绝对量损失。百分之一的损失作用于 100 pg 样品时是 1 pg；若作用于 1 µg 样品，比例仍是百分之一。真正随起始量减小而显著增大的是固定损失的占比，例如同样残留在器壁上的若干 pg 蛋白。此外，吸附常对不同分子具有选择性，不能由总回收率直接推出每种蛋白都保留了相同比例。

常规蛋白组学 · 1 µg 起始

总量：约 20 pmol、10¹³ 量级分子。
单步 1–5% 损失：仍会影响回收率，多步后可累积。
环境与试剂背景：即使低于样品的 1%，也应监测。
操作体积：常为微升级，需按体积校准移液性能。

单细胞 · 100–200 pg 起始

总量：约 2–4 fmol、10⁹ 量级分子。
固定绝对量损失：以 200 pg 比较，占比放大约五千倍。
同样背景：相对贡献增大，可能干扰低丰度肽段。
操作体积：可缩至纳升级，需验证分配精度与蒸发控制。

习题 2.1-1

某细胞总蛋白量 150 pg，蛋白平均摩尔质量按 50 kDa 计。（a）求总蛋白的物质的量（fmol）与分子总数；（b）某转录因子每细胞表达 2×10⁴ 个拷贝，摩尔质量 45 kDa，求它在单个细胞中的质量与物质的量；（c）结合（a）（b）说明，可用分子数怎样限制检测，又为什么仅凭总蛋白量不能确定检出限。

参考解答

（a）n = 1.5×10⁻¹⁰ g ÷ 5×10⁴ g/mol = 3×10⁻¹⁵ mol = 3 fmol；N = 3×10⁻¹⁵ × 6.02×10²³ ≈ 1.8×10⁹ 个分子。（b）质量 = 2×10⁴ × 45×10³ g/mol ÷ 6.02×10²³ ≈ 1.5×10⁻¹⁵ g ≈ 1.5 fg；n = 1.5×10⁻¹⁵ g ÷ 4.5×10⁴ g/mol ≈ 3.3×10⁻²⁰ mol ≈ 0.033 amol（33 zmol）。（c）1.5 fg 是该蛋白在这个细胞中的可用总量，制备与检测损失会进一步减少实际采集的分子数。但检出限还取决于背景、离子化与传输效率，以及鉴定阈值；相同总蛋白量的细胞也可能具有不同的丰度分布，因而不能仅凭总量判断某个蛋白能否检出。

2.1.2 表面吸附：接触面积与表面性质

蛋白与肽段可通过疏水、静电等相互作用吸附于器壁和吸头。吸附程度取决于暴露的疏水基团、分子与表面的电荷、pH、离子强度和溶剂组成；聚丙烯与玻璃也具有不同的表面性质，不能假定其作用相同。气液界面(air–liquid interface)同样需要考虑：部分蛋白可在水与空气的界面富集或发生构象变化，使溶液中的可回收量减少。

表面容量模型可用于估计吸附造成的量级限制。设表面形成一层吸附分子，即单分子层(monolayer)，并用单位面积的有效吸附质量描述容量。在近似达到该容量、且样品量足够时，有

\[\Delta m \approx \sigma \cdot A \quad \text{损失占比} f = \Delta m / m_{0} = \sigma A / m_{0}\]

(2.1-2)Δm 为损失质量；σ 为单位面积的有效吸附容量，A 为样品接触面积，m₀ 为起始质量。以下示意取 σ = 1 ng/cm²；1–100 ng/cm² 或 0.1–1 µg/cm² 等不同容量假设会给出不同估计，不能作为任意表面的固定参数。实际吸附还依赖浓度、接触时间与平衡状态；若 σA 超过 m₀，实际损失至多为全部样品，不能继续按该式外推。

以下计算仅为模型示例。把液滴近似为接触角不变的球冠，则接触面积 A ∝ V^2/3。1 µL 体系取 A ≈ 2.4×10⁻² cm²、σ = 1 ng/cm²，得到 Δm ≈ 24 pg；体积缩至 50 nL，即减小 20 倍，面积减小约 20^2/3 ≈ 7.4 倍，A ≈ 3.3×10⁻³ cm²，Δm ≈ 3.3 pg。按式 (2.1-2)，1 µg 样品在前一种体系中的估计损失占比约 0.002%；换成 100 pg 样品则约为 24%；改用 50 nL 液滴后约为 3%。这些百分比依赖所选参数，不是纳升级制备的通用回收率。

这一模型说明：在起始量、表面性质和几何形状近似不变时，减小反应体积可降低绝对接触面积。nanoPOTS 在纳升级液滴中完成 10–100 个哺乳动物细胞的制备，提高了该起始量下的蛋白覆盖深度（Zhu et al., 2018a）；后续微流体液滴方案扩展至单个细胞（Zhu et al., 2018b）。低吸附管、表面涂层与适用的添加剂则可改变有效吸附容量。图 2.1-1 展示的是固定 σA 时的比例关系：在模型有效范围内，样品量每减少十倍，估计损失占比增加十倍。

图 2.1-1　固定表面容量假设下的吸附损失占比（双对数坐标）。实线为 1 µL 体系，虚线为 50 nL 液滴，竖带标出单细胞 100–200 pg 的区间。模型有效范围内，两线斜率均为 −1；体积缩小 20 倍时，面积按 V^2/3 减至约 1/7。σ = 1 ng/cm² 是示意参数，图中百分比用于比较几何效应；实际回收率须测量，且损失不能超过 100%（作者依式 (2.1-2) 绘制；方法背景见 Zhu et al., 2018a, b）。

定义

吸附损失（adsorption loss）：样品分子吸附于器壁、吸头或气液界面，导致可回收量减少。其大小由接触面积、表面化学与溶液条件等共同决定；当吸附量未随样品量同步下降时，微量样品的相对损失更大（Zhu et al., 2018a）。

方法

降低吸附可从四个方面着手。第一，减小体积与接触面积，但同时控制蒸发。第二，根据样品与溶液选择表面，如低吸附（low-binding）聚丙烯管、经适当硅烷化的玻璃或氟碳涂层载片；nPOP 使用氟碳涂层载玻片承载纳升级液滴阵列（Leduc et al., 2024），各表面的实际回收率仍需验证。第三，在反应和检测允许的范围内优化 pH 与有机相比例，调节分子溶解性及表面相互作用。第四，考虑适用的表面活性剂或竞争吸附分子，同时评估新增背景与质谱兼容性。这些措施分别影响式 (2.1-2) 中的 A 或有效 σ，宜通过对照实验组合优化。

2.1.3 稀释与多步转移

自下而上流程可包括裂解、变性、还原、烷基化、酶解、酸化、浓缩和上样等环节。化学步骤与转移次数并不相同：多个反应可以在同一容器中先后完成，而每次吸取、弃液或换管都可能带来额外残留。为单独考察转移次数的影响，设每次转移的保留率均为 1 − x，共转移 n 次，则总回收率为

\[R = (1 - x)^{n}\]

(2.1-3)x 为单次转移的损失比例，n 为转移次数。式中假定各次保留率相同；若不同，总回收率应为各次保留率的乘积。这里不另计酶解不完全或其他反应损失。

若每次保留 95%，八次后 R = 0.95⁸ ≈ 66%；若每次保留 90%，则约为 43%。这种逐次相乘的复合损失说明，减少转移次数可以提高回收率。一步法(one-pot)把多项反应安排在同一容器或液滴内，减少样品转移；它不意味着所有反应同时发生，也不意味着除最终上样外再无损失。2.4 节介绍的 nPOP 将裂解、酶解和标记等操作组织为纳升级液滴流程（Leduc et al., 2024）。

稀释损失(dilution loss)指稀释引发的后续回收损失，稀释本身并不减少分子总数。为满足移液所需的体积而稀释样品，可能增加接触面积、改变吸附平衡，并增加进样前的浓缩操作。体积也不能无限减小：分配误差取决于设备、体积与液体性质；若误差达到百分之几十，反应条件就可能偏离设定。设计时应共同验证转移次数、反应体积、分配精度和蒸发，而不是单独追求最小液滴。

图 2.1-2　转移次数对回收率的影响（假设计算）。上图把八个环节各计作一次转移，每次保留 95%，总回收率约为 66%；下图将所示反应放在同一液滴，仅计最终一次转移，得到约 95%。图中仅比较转移损失，不代表常规流程必须换八次容器，也不是 nPOP 的实测回收率或逐步操作图。反应本身及样品收集仍可产生损失（式 (2.1-3)；单液滴方法实例见 Leduc et al., 2024）。

习题 2.1-2

某流程共 8 个涉及转移的步骤，每步保留 95%。（a）求最终回收率；（b）至少要累积多少步，总回收率才会跌破 50%？（c）若把 8 步合并为“一步法”（仅 1 次转移，保留率仍为 95%），回收率提高多少倍？结合式 (2.1-3) 说明一步法作为设计原则的依据。

参考解答

（a）R = 0.95⁸ ≈ 0.663，即约 66%。（b）令 0.95ⁿ < 0.5，两边取对数：n·ln 0.95 < ln 0.5；因 ln 0.95 为负，除以它时不等号反向，得到 n > 0.693 ÷ 0.0513 ≈ 13.5，故第 14 步起低于 50%。（c）一步法 R ≈ 95%，为原回收率的约 1.43 倍（95/66.3）。作为另一种改进，将单次保留率从 95% 提至 99%，八次后约为 92%。减少转移和提高单次回收率都有效，选择哪一种取决于反应兼容性、设备和操作成本。

2.1.4 污染与背景

样品之外的蛋白和化学成分会形成背景。角蛋白(keratin)可随皮屑、毛发和含角蛋白的纤维进入样品；环境微生物、酶制剂中的杂蛋白、试剂降解产物和耗材可浸出物也是潜在来源。其量与环境暴露、试剂用量及操作有关，通常不会随细胞起始量等比例减少。若以几个 pg 至几十、上百 pg 作为污染量示例，其对皮克级样品的影响已不能忽略；实际水平应由空白实验测定。

以质量比为例，10 pg 角蛋白相对于 1 µg 样品占 0.001%，相对于 100 pg 样品则占 10%。质量比并不直接等于质谱信号比，但它说明相同背景在单细胞测量中的相对贡献更大。背景肽段可能干扰目标离子的分离与采集，化学杂质也可能影响离子化，从而降低低丰度组分的可测性。

控制背景包括预防和监测。操作中可使用合适的手套、口罩、低粉尘耗材与洁净工作区，减少开盖暴露；试剂宜选择适用纯度并小量分装，减少反复取用。监测则需要空白通道(blank channel)：多重标记批次中不加入细胞、但按相同流程处理的通道。SCoPE2 利用这类对照评估背景（Specht et al., 2021）；社区规范也建议报告污染与背景指标（Gatto et al., 2023）。空白信号首先用于质量评估，是否能用于数值扣除还取决于背景模型。

注记

角蛋白需要结合实验来源判断。皮屑与毛发可带入足以干扰微量分析的蛋白，但角蛋白也可能是所测细胞的真实组分，不能仅凭蛋白名称一律删除。检索数据库中纳入常见污染序列，有助于识别来源；空白对照、样品类型和肽段证据则有助于判断其是否属于污染。操作时束起长发、及时更换受污染的手套，并减少样品暴露，可以降低这类背景。

警示

缺少空白对照时，低信号通道中的样品成分与背景更难区分。空白通道可帮助估计非细胞来源信号，以及交叉标记和残留污染等影响，但一个通道不一定代表整批样品的所有背景来源。设计时应明确其目的、处理方式与通道位置，并据此设定质量控制规则（Specht et al., 2021；Gatto et al., 2023）。

习题 2.1-3

某单细胞批次使用 16 通道 TMT 标记，其中 1 个为空白通道。（a）空白占用了多少比例的标记通道？（b）若空白通道中多条角蛋白肽段的信号约为各单细胞通道平均值的 5 倍，这说明什么？能否直接从每个通道扣除空白通道的数值？（c）结合 2.1.4 的背景控制措施，说明数值扣除为何不能替代污染预防。

参考解答

（a）1/16 ≈ 6.3%；若还有载体或参考通道，可用于单细胞的通道数还需另行计算。（b）空白中存在较强的角蛋白相关背景，但不能仅据此断定各细胞通道的同类信号全部来自污染。直接扣除要求背景在通道间具有可比性；标记效率、污染分布和空白本身的噪声都可能破坏这一条件。（c）数值扣除不能恢复未被采集的目标离子，也不能撤销背景在分离和离子化阶段造成的干扰。洁净操作与合适试剂用于减少背景，空白对照用于评估残余影响，校正则需建立在可验证的假设上。

2.1.5 动态范围与采样统计

蛋白的拷贝数(copy number)分布也限制了检测。Beck 等（2011）对人 U2OS 细胞系的群体测量估计，蛋白丰度可跨至少七个数量级；其中经参照肽段验证的定量区间约为每细胞数百至两千万（2×10⁷）拷贝，区间外估计的精度更有限。这里的动态范围(dynamic range)指丰度分布的跨度，不是每个细胞都必然具有的固定数值。以总量约 2 fmol 的样品为例，若某些蛋白处于 10⁵ 拷贝量级，另一些仅有 10²–10⁴，总量相同也不意味着各蛋白同样容易检测。

酶解、色谱回收、离子化、传输与采集会进一步影响可观察的离子数。低拷贝肽段到达检测器的期望离子数 λ 可能降至个位数。为说明离散采样的一种限制，可假定离子独立到达，且给定采集窗口内的平均到达率稳定，采用泊松采样(Poisson sampling)模型。此时，一个离子都未到达的概率为 e^−λ，至少到达一个的概率为

\[P(k \ge 1) = 1 - e^{-\lambda}\]

(2.1-4)λ 为该肽段在制备、分离、离子化、传输与采集后，于指定窗口到达检测器的期望离子数；k 为实际到达数。λ = 2 时 P ≈ 86%；λ = 0.5 时 P ≈ 39%；P 达到 95% 需要 λ ≈ 3。这是至少一个离子到达的概率，不能直接等同于肽段可靠鉴定的概率。

在该模型中，λ = 0.5 时约有六成采样窗口没有离子到达，尽管样品中存在相应肽段。这说明低离子数采样可以形成缺失值；实际缺失还涉及采集选择、干扰、信号阈值和软件鉴定等过程，不能全部归为泊松采样。图 2.1-3 展示式 (2.1-4) 的关系。第 4.4 节讨论填补时，将区分实际观测与基于其他细胞或肽段信息得到的估计。

图 2.1-3　泊松模型中至少一个离子到达的概率（式 (2.1-4)）。λ = 0.5 时约为 39%，λ = 2 时约为 86%，达到 95% 需要 λ ≈ 3。宽丰度分布中的低拷贝蛋白（Beck et al., 2011），经制备与检测链路后可能对应较小的 λ。图示说明一种采样限制；实际肽段鉴定还需要足够的谱图证据，缺失机制也不限于离子未到达。

习题 2.1-4

某低拷贝肽段在给定采集窗口内到达检测器的期望离子数 λ = 0.5，假定服从泊松模型。（a）求至少一个离子到达的概率；（b）若希望这一概率不低于 95%，λ 至少应为多少？（c）在 96 个细胞中，若各细胞均有 λ = 0.5，预计多少个细胞的采集窗口没有该肽段离子到达？这对第 4 章将讨论的缺失值填补意味着什么？

参考解答

（a）P(k ≥ 1) = 1 − e^−0.5 ≈ 1 − 0.607 = 0.393，约 39%。（b）令 1 − e^−λ ≥ 0.95，则 e^−λ ≤ 0.05，λ ≥ −ln 0.05 ≈ 3.0，即期望离子数须提高约六倍。（c）没有离子到达的概率为 e^−0.5 ≈ 0.607，96 个细胞中预计约 58 个没有离子到达，约 38 个至少有一个到达；后者仍不保证可靠鉴定。填补可借助其他细胞与肽段给出估计，但不能将估计视为恢复的实测值，分析时应保留相应不确定性（见 4.4 节）。

2.1.6 酶解在微量条件下的特殊困难

微量酶解需要同时控制酶量、浓度与反应条件。以常用的酶与底物 1:20–1:100 质量比计算，100 pg 底物对应皮克级酶量；实际能否稳定加入，取决于储液浓度、分配体积和设备性能，常规手动移液较难直接满足。若改用数纳克至十余纳克的酶，酶量可超过底物数十到数百倍，背景与反应条件就需重新评估。

首先是自溶(autolysis)背景。胰蛋白酶可切割酶分子自身，产生自溶肽段；酶量相对较高时，这些片段可能影响样品肽段的检测。应在检索与质量控制中识别酶来源肽段，并优化酶量和时间。经还原甲基化修饰的测序级胰蛋白酶可提高抗自溶能力，但仍需验证具体样品中的酶解效果。

其次是变性(denaturation)与酶活性的兼容性。尿素或去污剂有助于溶解和展开蛋白，浓度过高却可能抑制酶活性；稀释可改善酶解条件，但会增大体积。SDS 残留还可能干扰后续色谱和电喷雾，需要在上样前有效去除，或选择与质谱兼容的替代体系。微量流程可考虑适当浓度的尿素、温育、有机溶剂或热处理，各条件都应以回收率和漏切情况验证。

第三是反应顺序。还原(reduction)用于断开二硫键，烷基化(alkylation)用于封闭相应巯基；这些步骤并不必然要求换管。单容器流程可按兼容的顺序加入试剂，减少转移，但是否包含全部反应需由具体方法决定。nPOP 的流程包括同一液滴内的裂解、酶解和标记等操作，不能把图 2.1-2 的一般示意直接当作其完整实验步骤（Leduc et al., 2024）。

最后还要协调反应时间、蒸发和通量。纳升级液滴的蒸发会改变体积、盐浓度与反应条件，因而常需湿度、温度或覆盖措施。延长酶解时间不一定降低总体质量：nPOP 协议要求至少数小时，并建议在受控条件下进行更长时间或过夜酶解。其液滴阵列可并行处理样品，1–2 天制备 3,000 余个单细胞（Leduc et al., 2024）。评价流程时，应同时报告酶解质量、回收率与批量操作的重复性。

表 2.1-1微量样品制备的主要限制与设计措施
限制因素	物理来源	与样品量的关系	设计措施
表面吸附	器壁与气液界面的疏水、静电等作用	固定表面容量模型中，占比与样品量成反比；实际还依赖浓度与平衡	减小接触面积、选择表面与溶液条件、减少转移
稀释与多步转移	移液残留、器壁滞留及浓缩回收损失	单次保留率相同时，总回收率按 (1−x)ⁿ 下降	合并兼容反应、一步法、验证小体积分配精度
污染与背景	角蛋白、环境微生物、试剂与耗材杂质	背景量不随样品量同步减小，相对贡献可显著上升	洁净操作、适用试剂、空白对照与质量评估

100–200 pg 的起始量要求制备流程尽量保留低拷贝组分，同时控制外源背景。表面容量、多步回收与泊松采样模型分别说明了一种限制；其示意结果不能替代实际性能测量。后续方法比较将关注以下指标：

体积与表面：纳升级操作是否改善回收，以及蒸发和分配精度能否满足反应要求（Zhu et al., 2018a, b）；
转移与酶解：单容器流程是否减少操作损失，并保持适当的反应条件与酶解质量（Leduc et al., 2024）；
背景与对照：空白是否覆盖主要背景来源，低信号是否获得足够的质量证据（Specht et al., 2021；Gatto et al., 2023）。

2.2 节将讨论 SCoPE-MS 的等压载体设计：把单细胞与载体通道纳入同一 TMT 批次，利用合并后的肽段信号支持鉴定，再以报告离子区分各通道的定量信息。这一设计能改变采集条件，但单细胞自身提供的分子数仍是定量信息的基础。

关键术语

吸附损失 (adsorption loss): 分子吸附于接触表面造成的回收损失，受面积、表面化学与溶液条件影响。
气液界面 (air–liquid interface): 气相与液相的接触界面，部分蛋白可在此富集或发生构象变化。
单分子层 (monolayer): 表面上厚度约为一层分子的吸附层，可用于构建表面容量的简化模型。
稀释损失 (dilution loss): 为容纳多步操作而放大体积所引发的附加吸附、污染与浓缩损失。
一步法 (one-pot): 在同一容器或液滴内完成多项反应、减少样品转移的制备原则。
角蛋白 (keratin): 可随皮屑和毛发进入样品的蛋白家族；也可能是所测细胞的真实组分，需结合对照判断。
空白通道 (blank channel): 多重标记批次中不加细胞而按相同流程处理的通道，用于评估背景与技术影响。
拷贝数 (copy number): 某蛋白在单个细胞中的分子数，不同蛋白与细胞之间可相差多个数量级。
动态范围 (dynamic range): 本节指样品中蛋白丰度的跨度；与仪器能够可靠测量的动态范围需加以区分。
泊松采样 (Poisson sampling): 以独立随机到达描述计数的模型，至少一次到达的概率为 1 − e^−λ。
自溶 (autolysis): 蛋白酶切割酶分子自身的现象，可产生影响质谱分析的酶来源肽段。

参考文献与延伸阅读

Beck M, Schmidt A, Malmstroem J, et al. 2011. The quantitative proteome of a human cell line. Molecular Systems Biology 7: 549.
Gatto L, Aebersold R, Slavov N, et al. 2023. Initial recommendations for performing, benchmarking and reporting single-cell proteomics experiments. Nature Methods 20: 375–386.
Leduc A, Khoury L, Cantlon J, Khan S, Slavov N. 2024. Massively parallel sample preparation for multiplexed single-cell proteomics using nPOP. Nature Protocols.
Lin HJL, Webber KGI, Nwosu AJ, Kelly RT. 2024. Review and practical guide for getting started with single-cell proteomics. Proteomics 25(1–2): e202400021.
Specht H, Emmott E, Petelski AA, Huffman RG, Perlman DH, Serra M, Kharchenko P, Koller A, Slavov N. 2021. Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2. Genome Biology 22: 50.
Zhu Y, Piehowski PD, Zhao R, et al. 2018a. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10–100 mammalian cells. Nature Communications 9: 882.
Zhu Y, Clair G, Chrisler WB, et al. 2018b. Proteomic analysis of single mammalian cells enabled by microfluidic nanodroplet sample preparation and ultrasensitive nanoLC-MS. Angewandte Chemie International Edition 57: 12370–12374.