2.5 免标记与 DIA：多重标记之外的采集路线

摘要　多重标记并非组织单细胞采集的唯一方式。本节先分析免标记定量重新可行的灵敏度条件及其机时代价；继而深化数据非依赖采集的机理——窗口轮转、谱图库与免库两条鉴定路径、碎片离子定量——及其对缺失结构、定量精度与低输入兼容的意义；最后介绍 diaPASEF 的淌度扩展与 plexDIA 的同位素多路，并以四条路线对照收束。

2.5.1 免标记单细胞：为何重新可行

2.2–2.4 节的三条路线共用一个组织方式：把多个细胞装进同一针，用等压标记把它们编码进不同通道，再以载体通道把信号抬到可鉴定的高度。这是"以标记换机时"。本节换一条路：免标记定量(label-free quantification)——每针进样只放一个细胞，定量靠同一条肽段在不同 run 之间的峰面积比较，物理基础即 1.4.5 节的式 (1.4-2)：峰面积正比于到达检测器的离子数。标记试剂、载体通道、通道串扰，在这条路上从源头上不存在。

定义

免标记定量（label-free quantification）：不借助任何化学标记的定量策略。每个样品独立进样（单细胞工作里通常每针一个细胞），以同一条肽段的色谱峰面积——或 DIA 下的碎片峰面积——跨 run 比较。成立前提是离子化响应在同一条肽段上跨 run 稳定，因而可比性只在"肽段内、跨 run"成立，跨肽段依旧不可比（1.4.7）。

这条路过去走不通，卡在灵敏度。单个细胞约 100–200 pg 的肽段在 MS1 里只留下微弱信号，而数据依赖采集(data-dependent acquisition, DDA)的挑选规则按强度排名——1.4.6 节已经指出，名次边界受噪声与共洗脱的扰动，低信号区的挑选近乎掷签；峰面积定量又要求把峰形"看清"，信噪比不足时面积积分失真。近年的变化来自两头相加：制备端把样品损失压到纳升级（2.4 节的 nPOP，以及商品化的 Chip-Tip）；仪器端的灵敏度上探一至两个数量级（2.6 节展开）。两条曲线相交，免标记重新站上可行线：Chip-Tip 流程在免标记采集下从一个细胞定量超过 6,000 种蛋白（Ye et al., 2025）；全自动的免标记流程也在细胞挑选与上样自动化平台上跑通（Ctortecka et al., 2024）。

收益可以数出四项。其一，没有标记试剂的成本，也没有标记反应效率的变量；其二，没有载体通道——2.2–2.3 节讨论的载体相关假象（检出限被载体抬高、载体批次引入的额外变异）从机理上不存在；其三，没有通道之间的同位素不纯度与残留串扰要校正；其四，样品通量＝进样通量：新样品随时可以上机，不必把实验切成"每十几个细胞一批"的组织方式，跨批次的设计自由度更大。

代价同样清楚：没有批内多路。每针只装一个细胞，全部机时由单细胞独占；run 与 run 之间的仪器漂移直接进入数据，批次效应的形态与多重标记的批内结构不同，下游的归一化与批次校正策略也不同（第 4 章）。换言之，免标记拿数据结构换了机时——这笔账必须算清，而不是想当然地以为"省了试剂就是省了钱"。

警示

免标记不等于更便宜：试剂省下，机时翻倍。算一笔示意账：一针 100 min 梯度加进样与平衡约 2 h，24 h 约 12 针；16 重 TMT 同样的机时可测约 190 个单细胞（SCoPE2 正是以这类组织方式在 10 天机时里定量约 1,490 个细胞，Specht et al., 2021），免标记只测 12 个。梯度越长、深度要求越高，差距越大。免标记的合理场景是"用机时换深度与数据结构"，而非省钱的默认选项。

2.5.2 DIA 机理：窗口轮转与两条鉴定路径

免标记把"run 之间的一致性"推到台前，而一致性正是数据非依赖采集(data-independent acquisition, DIA)的设计目标。1.4.6 节给出过两种时间表的对比，这里往机理深处走一步。DIA 放弃挑选：把母离子质荷比范围划成首尾相接的窗口，逐窗轮转碎裂，循环往复。窗口内的离子无论强弱一起碎裂，谱图是叠加的混合物。采集决策从"挑谁"变成"按时间表全要"——时间表一经确定，覆盖便是确定性的。

混合谱图必须靠计算解开，鉴定路径有两条。其一，谱图库(spectral library)：先用 DDA 或浓缩样品测出目标肽段的参考碎裂谱（碎片组成、强度模式、保留时间），再在 DIA 数据里按库提取各肽段的信号。其二，免谱图库检索(library-free / directDIA)：不建实测库，直接对 DIA 谱图做数据库检索，或以深度学习预测的理论谱作虚拟库。DIA-NN 是两条路径的代表性引擎，以神经网络打分配合干扰校正，把大规模 DIA 数据的处理做到可控的假阳性（Demichev et al., 2020）。对单细胞，免库路径还有一层实际好处：样品本就稀少，再拿去建库过于奢侈。

定量发生在碎片离子层面。一条肽段有多个碎片离子，各自的提取色谱峰面积互为内部重复；算法按干扰程度挑出干净的碎片，加权给出肽段定量。与 MS1 峰面积相比，碎片面积离共洗脱干扰更近，单看一根碎片未必更准；但可用碎片多、可交叉验证、可剔除受干扰者，统计上更稳——这是 DIA 定量精度优势的来源，也是 DIA-NN 一类软件把干扰校正做成分量的原因（Demichev et al., 2020）。

还有一条机理，对单细胞是结构性的：DIA 不要求"先看到再碎"。DDA 里一个母离子若未被 MS1 检出、或强度排名不够，就永远没有 MS2；DIA 的窗口到点即碎，离子只要在窗口内就会被采集。单细胞样品的信号贴着检出限分布，"不必先看到"意味着低丰度肽段不再因为第一眼的强弱被排除在采集之外。

2.5.3 循环时间预算：DIA 对单细胞的三重意义

DIA 带给单细胞的第一重意义在缺失值结构。窗口时间表确定，同一肽段在同批每个 run 都会被覆盖：缺失更多反映"深度不够测到"，而非"运气不好没被选中"。缺失因此可预期，也更适合下游的填补与建模（第 4 章）。对照 DDA 的随机缺失——它把"测不到"与"不表达"搅在一起，缺失值本身成了混杂变量。

第二重在定量精度。碎片面积加多碎片平均，重复之间的变异更小；DIA 单细胞信息学流程的系统基准评测也显示，预处理的选择显著影响最终定量质量，而 DIA 数据在合理流程下能维持稳定的跨 run 一致性（Wang et al., 2025）。第三重在低输入兼容：如上一小节所述，不必先看到母离子也能采集——这一条只对"信号贴着检出限"的样品才称得上关键，常规微克级进样对此并不敏感。

三重意义都受同一条物理约束：循环时间。循环时间(cycle time)是完整走一遍全部窗口所需的时间，驻留时间(dwell time)是单个窗口一次碎裂停留的时长：

T_cycle ≈ N_win × t_dwell

(2.5-1)N_win 为循环内的窗口数，t_dwell 为单窗驻留时间（含隔离、碎裂与过渡开销的近似）；循环若还含 MS1 全扫描，其时长另计。例：32 窗 × 25 ms ≈ 0.8 s。色谱峰只在保留时间附近短暂出现，循环时间决定一个峰能被采到几个点。

T_cycle ≤ w_peak / 10

(2.5-2)w_peak 为色谱峰宽（基线附近计）。"每峰约 10 个采样点"是色谱定量的通行经验准则——点数不足则峰形失真、面积积分不稳。注意这是经验规则而非严格阈值。

于是窗口数与循环时间此消彼长：窗口越窄，共碎片越少、选择性越高；但窗口数增加直接抬高循环时间，压缩每峰采样点。单细胞常用的短梯度把峰压得更窄（约 10 s 量级），时间预算更紧。图 2.5-1 把两种时间表的 run 间覆盖差异与每峰采样点并排画出。工程折中包括按离子密度设置的可变窗宽（肽段密集处窄、稀疏处宽），以及 2.5.4 节的淌度扩展——后者换了一维坐标，把这笔账重算了一遍。

图 2.5-1　DDA 与 DIA 的 run 间覆盖差异与每峰采样点。上：DDA 按强度挑选，名次边界受噪声与动态排除扰动，同一肽段 P（虚线标记，同一 m/z）在三个 run 中时有时无，缺失呈随机性。中：DIA 以固定窗口轮转，时间表与强度无关，P 所在窗口（W6，高亮）每个循环必被采集，三个 run 全部检出。下：循环时间 T ≈ 窗口数 × 单窗驻留时间；T = 0.8 s 对约 10 s 的色谱峰给出每峰约 12 个采样点，满足"每峰约 10 点"的经验准则，而 T = 4 s 时峰形失真、面积积分不稳（作者整理）。

注记

循环时间准则的来历：峰面积定量的随机误差随每峰采样点数增加而下降，色谱学经验上约 10 点之后边际收益递减，故常引作采集设计约束。它是经验规则：若更长的循环换来明显更干净的谱图（更窄的窗口、更少的共碎片），在某些场景反而合算。准则服务于"定量保真"这一目的，满足它不是仪式，压着它也不必然失败——但偏离时要能说出代价是什么。

习题 2.5-1

某 DIA 方法把 400 Th 的母离子范围均分为 32 个窗口，每窗驻留 25 ms；目标肽段的色谱峰宽约 10 s（基线计）。（a）求循环时间。（b）每个色谱峰能采到多少个点？（c）按式 (2.5-2) 的经验准则判断是否达标。（d）若把窗口数加倍到 64（窗口更窄、谱图更干净）而驻留时间不变，循环时间与每峰点数如何变化？给出两种恢复达标的办法并说明各自的代价。

参考解答

（a）按式 (2.5-1)，T = 32 × 25 ms = 800 ms = 0.8 s。（b）点数 ≈ 峰宽 / 循环时间 = 10 / 0.8 = 12.5，即每峰约 12–13 点。（c）准则要求 T ≤ 10/10 = 1 s；0.8 s < 1 s，达标且略有富余。（d）T = 64 × 25 ms = 1.6 s，每峰约 6–7 点，低于约 10 点，峰形开始失真、面积积分不稳。恢复办法一：缩短驻留时间至约 12.5 ms（T ≈ 0.8 s），代价是每窗离子数减少、信噪比下降；办法二：收窄扫描的 m/z 范围或改用可变窗宽，把窗口数压回时间预算之内，代价是覆盖范围或窗口均匀性。

2.5.4 diaPASEF：在淌度维再分一维

离子淌度(ion mobility)给质谱加了独立于质荷比的一维分离：气相离子在缓冲气体中漂移，速率由电荷与碰撞截面(collisional cross section, CCS)共同决定——同一个 m/z 下，形状不同的离子淌度不同。对 DIA 的意义直接明了：淌度把窗口内的离子再摊开一层，共碎片干扰随之下降，谱图更干净。

timsTOF 平台的陷俘离子淌度(trapped ion mobility spectrometry, TIMS)把这件事做成了"排队"：离子在电场与反向气流的対峙中被拦住、并行累积(parallel accumulation)，再按淌度从快到慢依次释放(serial release)；四极杆的隔离窗口与释放时刻同步扫描，这就是 PASEF（平行累积－串行碎裂）。关键收益在离子利用率：累积时不丢、释放时有序，洗脱出来的离子几乎个个都被碎裂采集。灵敏度按"用了多少离子"来算，而离子恰恰是单细胞最缺的资源（Meier et al., 2020）。

diaPASEF 再把 DIA 的窗口搬进 m/z–淌度平面。肽段的淌度与其 m/z 大体正相关，在平面上呈一条对角分布带；diaPASEF 的窗口沿对角线"斜切"——单个窗口横跨很宽的 m/z，却只取窄窄一片淌度，一次循环即扫过整条分布带。窗口按离子数计的等效宽度，远小于它在 m/z 轴上的投影：同样是"覆盖全部离子"，平面上的窗口设计让每个窗口承载的离子更少、谱图更干净（图 2.5-2）。当前单细胞深度的最好成绩多出自该平台（Ye et al., 2025；2.6 节展开）。

图 2.5-2　diaPASEF 的 m/z–淌度平面（示意）。左：TIMS 淌度阱把离子并行累积、按淌度依次释放，四极杆隔离窗口与释放时刻同步扫描（PASEF），洗脱离子的利用率接近百分之百。右：肽段的淌度与 m/z 大体正相关，在 m/z–1/K₀ 平面上呈对角分布带（点群）；diaPASEF 的窗口沿对角线斜切——单个窗口横跨很宽的 m/z 而只取窄淌度片（高亮），一次循环扫过整条分布带，且同一窗口内的离子在淌度维再分散，共碎片干扰下降（Meier et al., 2020；作者整理）。

2.5.5 plexDIA：同位素标记与 DIA 合流

DIA 给一致性与低输入兼容，多重标记给通量。plexDIA 把两者合到一次采集里：样品用 mTRAQ 试剂标记后混合，再走 DIA。mTRAQ 属同位素标记(isotopic labeling)，与 2.2 节的等压标记(isobaric labeling)差别写在质量轴上：它的三个通道（Δ0、Δ4、Δ8）彼此相差固定的 4 Da，标记后同一条肽段在 MS1 里呈现三个可分辨的母离子峰；等压标记的各通道总质量相同，MS1 里只有一个峰。这一差别决定了两条路线各自适配的采集方式。

采集与读出的机理如下。三个通道的母离子间距为 4/z Th（z 为电荷），远小于窗口宽度，于是落入同一 DIA 窗口、一起碎裂；含标签末端的碎片同样按质量差错开，三套碎片可分。通道身份由母离子质量直接给出——不需要报告离子(reporter ion)；定量取各通道的母离子与碎片面积之比。与 TMT 载体路线对照，三处本质不同：没有载体通道（每个通道都是样品），没有报告离子层（比率在母离子与碎片层面读出），报告离子共碎片造成的比值压缩在机理上不存在；窗口内的共碎片干扰仍在，交给干扰校正处理。

辨析

同位素标记与等压标记：同位素标记（mTRAQ）通道间有固定质量差（相邻 4 Da），MS1 可分辨，通道身份在碎裂之前已知，碎裂后各通道碎片成套错开——天然适配 DIA 的同窗共碎。等压标记（TMT）通道总质量相同，MS1 不可分，身份只能由碎裂后的报告离子携带，定量必须搬进 MS2——天然适配 DDA 的单母离子碎裂。前者无报告离子与载体之需，后者通道数更多（十余重对三重），两条路线各自的长短即由此而来。

性能账目清晰：通量随标记通道数成倍增长，而蛋白覆盖与定量精度大体保持（Derks et al., 2023）。工具链也已就位：DIA-NN 内置 plexDIA 模块，把三通道的碎片提取、干扰校正与比率计算纳入同一流程（Derks et al., 2023）。定位上，plexDIA 在"免标记 DIA 的一致性"与"TMT 的通量"之间取中——每针 2–3 个细胞，机时按通道数摊薄，批次结构仍由确定的窗口时间表保证。

习题 2.5-2

mTRAQ 三通道（Δ0、Δ4、Δ8）分别标记三个单细胞样品，混合后走 plexDIA。某肽段为双电荷（z = 2）。（a）MS1 中相邻两通道的母离子 m/z 间距是多少？（b）设 DIA 窗口宽 12.5 Th，三通道母离子会落入同一窗口吗？一起碎裂后各通道的碎片如何区分？（c）与 TMT 载体路线对照：plexDIA 为什么既不需要载体通道、也不需要报告离子？

参考解答

（a）通道间中性质量差 4 Da，双电荷下 m/z 间距 = 4/2 = 2 Th。（b）三峰总跨度 2 × 2 = 4 Th，小于 12.5 Th，落入同一窗口一起碎裂；含标签末端的碎片按同样的质量差错开（碎片层面为 4/z Th 的成套偏移），形成三套可分的碎片，各通道定量取其母离子与碎片峰面积。（c）通道身份由母离子质量差直接给出，碎裂之前已经知道"这是哪个通道"，故无需报告离子；比率在母离子与碎片层面读出，信号来自样品通道本身，鉴定不依赖载体放大，故无需载体通道。代价是通道数目前远少于 TMT（3 对十余重），单针通量增益有限，但每个通道都是真实样品。

2.5.6 四条采集路线的对照

把本章出现过的采集组织方式放进同一张表：免标记 DDA、免标记 DIA、plexDIA、TMT 载体 DDA。四条路线不是优劣排序，而是"机时、缺失结构、定量假象"三笔账的不同配平（表 2.5-1）；社区报告规范也要求明示采集方式、定量层级与缺失值的成因，而非只报一个蛋白总数（Gatto et al., 2023）。

表 2.5-1四条采集路线在通量、缺失结构与定量假象上的对照
路线	每针细胞数	机时通量	缺失值结构	主要定量假象	试剂与机时
免标记 DDA	1	最低	随机缺失多，run 间覆盖漂移	无标记与载体假象；低信号区挑选随机	试剂省；机时最高
免标记 DIA	1	低	覆盖一致，缺失多为深度不足	窗口内共碎片干扰，须算法校正	试剂省；机时高
plexDIA（mTRAQ）	2–3	中，随通道数成倍增	通道同时覆盖，缺失少且可预期	通道间同位素干扰与窗口共碎片	试剂中等；机时摊薄至 1/2–1/3
TMT 载体 DDA	十余（另设载体通道）	最高	随机缺失＋通道缺失	比值压缩；载体抬高定量下限、引入批次变异	试剂贵；机时最低（按细胞计）

表上的每一格都能追溯到机理：免标记 DDA 的缺失来自强度挑选的随机性；免标记 DIA 用确定的时间表换掉它；plexDIA 在此之上以质量差分通道、按通道数摊薄机时；TMT 路线通量最高，但把定量搬进报告离子层，载体与比值压缩的账要另算（2.2–2.3 节）。2.6 节将从仪器端继续推这张表的边界。

习题 2.5-3

三个实验场景，请分别从表 2.5-1 的四条路线中选择并说明理由。（i）稀有细胞共 24 个，机时紧张，实验室无淌度仪器，只关注细胞类型间的粗粒度差异；（ii）要尽可能深地覆盖单个细胞的低丰度蛋白（如激酶），机时不敏感；（iii）一周内分 5 个批次采集约 150 个细胞，最担心批次之间不可比。

参考解答

（i）TMT 载体 DDA（SCoPE2 型）：两针 16 重即可装下全部细胞与载体参比通道，机时最省；载体帮助鉴定，粗粒度的类型间差异对比值压缩不敏感。（ii）免标记 DIA——深度优先，无载体与报告离子层，低丰度肽段的碎片定量更稳；若有 timsTOF 平台则用 diaPASEF（Ye et al., 2025 一类流程）。（iii）plexDIA 或免标记 DIA：窗口时间表确定、跨 run 覆盖一致，批次结构可预期；plexDIA 每针 3 个细胞，把 150 个细胞压到 50 针，批次内还可用同一试剂批与同一窗口表压缩额外变异。三种场景对应三笔账的不同配平，没有普适的最优解。

本节把采集层的设计空间摊开。免标记与多重标记并非对立路线，而是在机时、缺失结构与定量假象之间取不同的配平：

免标记：每针一个细胞，无试剂与载体假象，机时全部由单细胞独占；其可行性由制备与仪器两端的灵敏度进步重新确立；
DIA：以窗口轮转替代强度挑选，覆盖确定、缺失可预期，碎片离子层面的定量更稳；循环时间与峰宽的预算（式 2.5-1、2.5-2）是设计核心；
diaPASEF：离子淌度把窗口内的离子再分一维，斜切窗口沿对角分布带扫过，洗脱离子的利用率接近百分之百；
plexDIA：同位素标记与 DIA 合流，通量随通道数成倍增长，比率在母离子与碎片层面读出，既无载体也无报告离子。

采集策略的收益最终都要落回仪器本身的离子利用与扫描速度。2.6 节转向硬件：新型质量分析器、离子淌度与自动进样如何继续抬高深度与通量的边界。

关键术语

免标记定量 (label-free quantification): 不借助化学标记、按同一条肽段的峰面积跨 run 比较的定量方式，每针一个样品。
数据非依赖采集 (data-independent acquisition): 以固定窗口轮转碎裂、全范围确定覆盖的采集模式（DIA）。
谱图库 (spectral library): 预先测得的肽段参考碎裂谱集合，供 DIA 数据解卷积与信号提取。
免谱图库检索 (library-free / directDIA): 不依赖实测库、直接检索或以预测谱图解码 DIA 数据的鉴定路径。
循环时间 (cycle time): 完整走一遍全部采集窗口所需的时间，决定每个色谱峰的采样点数。
驻留时间 (dwell time): 单个窗口一次碎裂停留的时长，循环时间的构成单元。
离子淌度 (ion mobility): 气相离子按碰撞截面在缓冲气体中漂移分离的额外一维。
碰撞截面 (collisional cross section): 离子与缓冲气体碰撞的等效面积，淌度分离的物理依据。
陷俘离子淌度 (trapped ion mobility spectrometry): 在阱中并行累积离子、按淌度依次释放的淌度分离实现（TIMS）。
同位素标记 (isotopic labeling): 通道间具固定质量差的标记（如 mTRAQ），MS1 即可分辨通道。
plexDIA (plexDIA): 同位素标记与 DIA 的组合采集策略，通量随标记通道数成倍增长。

参考文献与延伸阅读

Demichev V, Messner CB, Vernardis SI, Lilley KS, Ralser M. 2020. DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nature Methods 17(1): 41–44.
Meier F, Brunner AD, Koch S, et al. 2020. diaPASEF: parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nature Methods 17: 1229–1236.
Derks J, Derks J, Leduc A, Masselon C, et al. 2023. Increasing the throughput of sensitive proteomics by plexDIA. Nature Biotechnology.
Ye Z, Sabatier P, et al. 2025. Enhanced sensitivity and scalability with a Chip-Tip workflow enables deep single-cell proteomics. Nature Methods 22: 499–509.
Ctortecka C, et al. 2024. Automated single-cell proteomics providing sufficient proteome depth to study complex biology beyond cell type classifications. Nature Communications 15: 2474.
Wang J, Huang Y, Fang Q. 2025. Benchmarking informatics workflows for data-independent acquisition single-cell proteomics. Nature Communications 16.
Specht H, Emmott E, Petelski AA, Huffman RG, Perlman DH, Koller A, Slavov N. 2021. Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2. Genome Biology 22: 50.
Gatto L, Aebersold R, Slavov N, et al. 2023. Initial recommendations for performing, benchmarking and reporting single-cell proteomics experiments. Nature Methods 20: 375–386.