2.4 nPOP：纳升级一步法与规模化制备

摘要　样品制备是单细胞质谱链条上损耗最重的一环。本节剖析 nPOP 的一步法（one-pot）路线：裂解、酶解与标记全部发生在同一纳升级液滴内，样品零转移，从源头消除多步流程的复合损失；氟碳涂层玻片、压电分液与湿度—露点控制让数千液滴稳定成球、按阵列定位。随后讨论流程规模、同族平台与质控，以及通量上千后瓶颈向机时的转移。

2.4.1 一步法的机理：零转移消灭复合损失

2.1 节算过一笔账：单个哺乳动物细胞只有约 100–200 pg 蛋白，而常规制备在离心管与孔板之间辗转，每次转移都在管壁、枪头与液面留下一份样品。设每次转移的回收比例为 x，全程共 n 次转移，最终回收率便是乘积：

R = xⁿ

(2.4-1)x 为单次转移的回收比例（0 < x ≤ 1），n 为转移次数，R 为全程回收率。损失不相加而相乘：x = 0.9、n = 6 时 R ≈ 53%；x = 0.95、n = 10 时 R ≈ 60%。转移越多，复合损失越陡。

对付式 (2.4-1) 的复合转移损失(transfer loss)，思路有二。其一是做大 x：低吸附管材、优化溶剂、缩短流程，让每一步少丢一点。其二是缩小 n：把裂解、酶解、标记安排进同一个容器，中途不搬家。一步法(one-pot)即第二条路——所有反应共享同一份体积，转移次数归零；n = 1 时 R = x，回收率的上限不再随步骤数滑坡。一步法的成立有一个化学前提：各步试剂必须彼此兼容、并与质谱兼容，中途不能靠清洗或除盐除掉任何东西。变性剂、去垢剂与缓冲体系因此都要重新选择，传统流程里的许多"标配"环节必须重新审视，甚至取消。

nPOP 把这条路线推到纳升级。实测口径：单细胞的报告离子强度达到 5 细胞参考样预期比值的约 95%，即一步法制备向质谱递送蛋白的效率约为优化批量制备的 95%（Leduc et al., 2022）。图 2.4-1 把两条路线的损失结构并排画出：同样的每步回收，多步管式流程沿 xⁿ 曲线下滑，一步法停在 n = 1 处。

图 2.4-1　多步管式流程与一步法的损失对照。A：裂解、变性、还原烷基化、酶解、标记、进样各步之间的转移使回收率按 xⁿ 复合衰减，x = 0.9、六次转移后仅余约 53%。B：一步法把各反应压进同一液滴，仅合并收集一次，n = 1 时回收率即每步回收 x。C：不同每步回收 x 下回收率随转移次数的衰减曲线，虚线标出 n = 6（Leduc et al., 2022；作者整理）。

定义

一步法（one-pot preparation）：样品制备的全部化学反应——裂解、酶解、标记（必要时还有淬灭）——在同一容器、同一份体积内依次完成，中途不转移、不清洗的制备方式。其收益是把式 (2.4-1) 中的转移次数 n 压到 1，消除复合转移损失；其代价是各步试剂必须互相兼容并与质谱兼容，凡需要除去的试剂都不能进入流程。

习题 2.4-1

（a）某多步流程共 6 次转移，每次回收 x = 0.9，求总回收率，并与只经历 1 次转移（回收同为 0.9）的一步法对比。（b）若改用低吸附耗材把每次回收提到 x = 0.95，但流程增至 10 次转移，总回收率是多少？说明了什么？（c）要在 8 次转移下保住 80% 的总回收，每次转移的回收至少要多少？

参考解答

（a）按式 (2.4-1)，R = 0.9⁶ ≈ 0.531，约 53%；一步法 R = 0.9，两者相差约 37 个百分点——差距来自步骤数的复利，不是单步工艺。（b）R = 0.95¹⁰ ≈ 0.599，约 60%：单步回收从 90% 提到 95%（损失减半）仍抵不过步数从 6 增到 10，减小 n 比做大 x 更根本。（c）需 x ≥ 0.8^1/8 = e^ln0.8/8 ≈ e^−0.0279 ≈ 0.973，即每次转移的损失不得超过约 2.7%——对皮克级样品而言极其苛刻，这正是一步法吸引力的定量根源。

2.4.2 载体平台：疏水表面上的液滴阵列

nPOP（Nano ProteOmic sample Preparation，纳升级蛋白组学样品制备）的平台是一片普通显微镜载玻片，表面加氟碳涂层(fluorocarbon coating)。碳氟链的表面能极低、对水的接触角很大，液滴落上去自发成球而不铺展；一个个球冠状液滴立在玻片上，位置即坐标——分液头按坐标阵列逐点布液，液滴便各就各位、互不串门。玻片没有孔、没有壁，样品密度只受液滴间距约束：簇内液滴中心距约 0.7–0.8 mm、簇间距约 1 mm 时，一片玻片可容纳 36 簇 × 14 液滴共 504 个样品位（Leduc et al., 2022）。无图案的平面还带来一项柔性：布局由软件文件定义，换一套多重标记方案只改文件、不改硬件。

注记

氟碳涂层为什么留得住液滴。固-液界面的润湿性由表面能与接触角决定：普通玻璃亲水，水滴铺展成膜，纳升级体积顷刻蒸发殆尽。氟碳链中 C–F 键的极化率低、表面能极小，水在其上的接触角可超过一百度，液滴收缩成近似球冠，与表面的接触面积降到最小。三重后果：液滴不易横向漫流，坐标定位稳定；暴露在空气中的蒸发面接近球形最小面；样品与表面的接触线短，界面吸附相应减少。超疏水在这里不是清洁功能的延续，而是把"平面"变成"无量孔板"的物理前提。

布液与挑细胞交给非接触分液。方法论文以 cellenONE 系统的压电分液(piezoelectric dispensing)实现：压电陶瓷驱动毛细管喷出皮升级液滴，单细胞随约 300 pL 的液滴逐个落入预定位置；仪器按细胞直径与伸长率设门，双联体和碎片被挡在门外。试剂同样以皮升级增量逐滴累积到纳升级。设计原则并不绑定平台，同类的声学移液(acoustic dispensing)（声滴喷射，如 Echo 类仪器）也能承担试剂布放（Leduc et al., 2022; 2024）。等压载体(isobaric carrier)通道则不出现在玻片上：载体在收集阶段才与单细胞汇合（见 2.4.3）。

纳升级液滴的敌人是蒸发：一个 20 nL 的水滴在开放的室温表面几分钟即干。nPOP 不用油封，而以三重措施协同：腔内相对湿度维持约 75%；玻片温度动态跟随露点(dew point)（控制在露点附近约 1–2 °C 以内），冷表面让水汽宁凝回液滴也不逸散；样品阵列四周再布一圈水滴，垫高局部湿度（Leduc et al., 2022）。液滴因此能在玻片上安然度过数小时的温育。

化学链路在液滴内一次走完：先布 100% DMSO 液滴（约 8 nL），单细胞落入后约 10 min 完成裂解——DMSO 蒸气压低、液滴经久不干，又与质谱兼容，实现免清洗制备(cleanup-free preparation)；随后加 12 nL 含胰酶的缓冲液（每细胞用酶约 1.8 ng，约为孔板方案的六分之一），温育 4 h；TMT 标签溶在 DMSO 中加入，标记约 1 h，再以羟胺淬灭(quenching)多余标签。单液滴总体积约 8–20 nL。为守住"免清洗"，nPOP 甚至省去还原烷基化：半胱氨酸不做酰胺甲基化，检索时关闭相应固定修饰；代价是漏切率(missed-cleavage rate)约 5–10%、二硫键肽段的覆盖受限——用化学上的删减换转移次数归零（Leduc et al., 2022）。整个流程见图 2.4-2。

图 2.4-2　nPOP 玻片俯视与一步法时间轴。A：氟碳涂层玻片上按阵列布放 36 簇液滴，每簇 14 个液滴位对应一组多重通道（TMTpro 18 重中 1 通道载体、1 通道参考、贴近载体的 2 通道弃用，余 14 通道给单细胞）；放大图示一簇的构成，含空白对照位；载体与参考样在收集孔中预载。B：单液滴内依次完成 DMSO 裂解、酶解、TMT 标记与淬灭，仅收集时按簇合并一次（Leduc et al., 2022; 2024；作者整理）。

2.4.3 流程规模：从玻片到质谱

规模由布局决定。TMTpro 18 重方案下，1 通道给载体、1 通道给参考样、紧邻载体的 2 个通道因报告离子同位素溢流而弃用，余下 14 个通道留给单细胞——每簇即 14 个液滴；一片 36 簇，四片一轮共 2,016 个液滴。2022 年的演示实验一轮布下约 1,888 个单细胞液滴与 128 个空白液滴，1 天完成，动手时间约 4 h（Leduc et al., 2022）。2024 年的协议论文按标记方案核算产率：多重方案下每片约 896 个单细胞，四片一轮可达约 3,500 个，1–2 天完成 3,000 余个单细胞的制备（Leduc et al., 2024）。

人力开销同样被压平。一轮约 2,000 个样品中，布 DMSO、挑细胞与加酶合计约 3 h，标记与淬灭约 1 h，收集平均每个样品约 1 min（含分液头清洗）——动手时间约 4 h，其余是温育等待（Leduc et al., 2022）。除涂层玻片外不依赖专用耗材；协议论文把布局、门控与体积参数完整成文，便于不同实验室照单复制（Leduc et al., 2024）。

制备的终点是收集与上机：分液头按簇把标记好的液滴逐一吸入、合并为一组，注入预载载体（或水）的 384 孔板；孔板 sealing 后即可放入自动进样器，LC-MS/MS 按组分析。等压载体通道在收集孔中与单细胞通道汇合，载体的作用与 2.2 节的分析一致——垫高离子信号、支撑鉴定，而不参与单细胞间的相对定量。试剂成本折合每细胞约 0.12 美元，其中标记试剂约 8 美分（Leduc et al., 2022）。

这个量级的意义要放在链条里看：SCoPE2 时代的质谱产能在每天数百个细胞的量级（Specht et al., 2021），制备若仍以每管一个细胞的速度推进，批次会碎成几十上百个小批，批次间的背景差异随即淹没细胞间的生物差异。大批次本身就是一种质控——同一轮玻片上的所有细胞共享同一份试剂、同一套温度与湿度史，批次效应被摊薄而非累积（Slavov, 2022）。

2.4.4 同族与邻居：mPOP、nanoPOTS 与芯片化

一步法并非 nPOP 的发明。同一实验室的 mPOP(Minimal ProteOmic sample Preparation)先行把裂解、酶解、标记压进微孔板的同一个孔：以冻至 −80 °C 再加热 90 °C 约 10 min 的冻融-加热方式裂解，全程只用与质谱兼容的试剂，免清洗、免转移（Specht et al., 2018；Petelski et al., 2021）。nPOP 继承其化学框架，把容器从微升级的孔换到纳升级的液滴，通量随之从每板百级升到每轮千级，且单细胞由分液头逐个挑选、全程可追溯。

更早的纳升级先行者是 nanoPOTS（Zhu et al., 2018）：在玻璃芯片刻蚀的纳升级反应孔（约 200 nL）中完成处理，机械臂布液，面向 10–100 个细胞的深度覆盖。它证明了纳升体积对灵敏度的收益，但孔数固定于芯片构型，通量受孔数约束。商品化方向则把一步法搬上专用芯片：cellenONE 皮升级打印配合 proteoCHIP 系列芯片，制备产物并入 Evotip 储存尖构成 Chip-Tip 工作流，单细胞定量深度超过 6,000 种蛋白（含 168 种激酶、逾 200 种膜蛋白）（Ye et al., 2025）；cellenONE 挑选配 proteoCHIP 与 timsTOF Ultra 的免标记自动流程亦已跑通（Ctortecka et al., 2024）。各平台的定位见表 2.4-1。

表 2.4-1纳升级与一步法样品制备平台对比
平台	反应载体与体积	样品量级	关键设计与出处
mPOP（微孔板一步法）	96/384 孔板，微升级同孔完成	单细胞至小批量	冻融-加热裂解；仅用质谱兼容试剂，免清洗（Specht et al., 2018；Petelski et al., 2021）
nPOP（玻片液滴）	氟碳涂层玻片，约 8–20 nL 液滴	数千单细胞 / 1–2 天	零转移一步法；压电分液布阵列；湿度＋露点＋水圈控蒸发（Leduc et al., 2022; 2024）
nanoPOTS（芯片纳米孔）	玻璃芯片刻蚀孔，约 200 nL	10–100 个细胞	纳升级制备的先行平台，孔数固定（Zhu et al., 2018）
proteoCHIP / Chip-Tip（商品化）	cellenONE 打印入芯片反应孔	单细胞	一步法芯片化；产物并入 Evotip，免标记与深度工作流皆有（Ctortecka et al., 2024；Ye et al., 2025）

2.4.5 失败模式与质控：空白液滴的底噪档案

液滴阵列的失败模式与孔板不同。其一是定位与融合：布液坐标漂移、液滴间距过近或体积过大，相邻液滴可能并滴——两份样品合为一体，通道身份随即混淆。其二是交叉污染：分液溅射把上一液滴的内容物带入邻位，收集抽吸时液滴间相互沾染，或分液头清洗不彻底造成残留污染(carry-over)。其三是表面残留：疏水表面把吸附压到很低，却压不到零，收集不完全同样损失样品。

因此每一片都要布空白。空白液滴(negative-control droplet)走完全相同的化学流程，唯独不落入细胞——它测到的任何信号都来自试剂杂质、溅射或残留，即制备批次的底噪。2022 年那轮 2,016 个液滴中，128 个是空白：多数肽段在空白中测不到，空白平均强度约为单细胞的二十分之一，TMT 标记特异性约 99%（Leduc et al., 2022）。空白与载体通道一起，构成每轮制备的质控档案：空白超标提示交叉污染或残留，单细胞对 5 细胞参考样的强度比偏离预期则提示递送效率异常。

警示

交叉污染要靠空白监控，不能靠肉眼。液滴尺度的沾染不改变外观，只在数据里现形。读数时盯三件事：空白液滴的肽段信号占比——偏高即提示溅射或残留；同一簇内通道间的报告离子串扰——贴近载体通道的样品尤甚；分液头前后样品的强度漂移——提示清洗不足。社区报告规范要求把阴性对照与这类制备层指标随数据一同发表，而非事后补做（Gatto et al., 2023）。

方法

空白液滴怎么布。按簇混布优于集中一隅：每簇固定留 1 个液滴位不落细胞（2022 年实验约 128 个空白散布于 144 个簇），使每个位置、每种试剂批次都有邻近的底噪参照。空白数据不作填补、不作剔除，原样随数据发布；分析时以空白强度分布定检出背景，单细胞信号低于背景若干倍者按低质量剔除。这一设计成本低——一个液滴位换一份位置相关的底噪记录。

习题 2.4-2

某实验室按 nPOP 的 TMTpro 18 重布局制备单细胞：每簇 14 个液滴位，每片 36 簇。（a）四片一轮共多少液滴位？若其中 128 个为空白，单细胞液滴多少？（b）按 2024 年协议的多重方案产率（每片约 896 个单细胞），要备齐 3,000 个单细胞至少几片？可得多少？（c）若改用 mTRAQ 3 重布局（每簇 3 液滴、每片 64 簇），四片一轮的单细胞数与液滴位利用率如何变化？

参考解答

（a）4 × 36 × 14 = 2,016 个液滴位；单细胞液滴 2,016 − 128 = 1,888 个。（b）⌈3,000 / 896⌉ = 4 片，可得约 4 × 896 = 3,584 个单细胞液滴，富余约 19%——多制备的液滴正好覆盖分析阶段的样品损失（细胞剔除、LC 故障等）。（c）四片一轮为 4 × 64 × 3 = 768 个单细胞液滴，仅约为 18 重方案的 40%：每簇通道数从 14 降到 3，单份 LC-MS/MS 摊到的细胞数同步减少，液滴位利用率下降——多重数与玻片利用率是同向的，这正是高重数标记对制备通量的放大作用（见 2.4.6）。

2.4.6 规模化之后：瓶颈向机时转移

制备通量上千之后，链条上最慢的一环换了位置。一轮 3,000 个单细胞，按 18 重方案每组 14 个单细胞计约 214 组 LC-MS/MS；每组约 100 min，连续机时约 357 h——昼夜不停也要约 15 天，而制备只花 1–2 天。移液不再是瓶颈，质谱机时成了新瓶颈：

T = (C / p) · t

(2.4-2)T 为总机时，C 为单细胞数，p 为每组（每次进样）分摊的单细胞通道数，t 为单次 LC-MS/MS 时长。例：C = 3,000、p = 14、t = 100 min，则 T ≈ 21,400 min ≈ 357 h ≈ 15 昼夜。机时随 p 增大而反比下降、随 t 缩短而线性下降。

式 (2.4-2) 指出两条缓解方向。其一是增大 p：更高重数的等压或同位素标记让每次进样承载更多细胞，标记化学与采集方法的组合经济学正是 2.5 节的主题（免标记路线则把 p 压回 1，另有一套权衡）。其二是缩短 t：更快的仪器、更短的梯度、更高的灵敏度——2.6 节的仪器前沿。一步法解决的是"样从哪里来"；"机时从哪里来"，要靠采集策略与仪器一起回答。

习题 2.4-3

接式 (2.4-2)：C = 3,000 个单细胞。（a）18 重方案（p = 14）与 mTRAQ 3 重方案（p = 3）在 t = 100 min 下的总机时各多少？差异说明什么？（b）若仪器与梯度改进使 t 降至 60 min，18 重方案的总机时变为多少？（c）讨论：把 t 压得更短，会不会反过来伤害鉴定深度？这与 2.6 节的仪器设计有何关联？

参考解答

（a）p = 14：T = (3,000/14) × 100 ≈ 21,430 min ≈ 357 h ≈ 14.9 天；p = 3：T = 1,000 × 100 = 100,000 min ≈ 1,667 h ≈ 69 天。多重数从 3 升到 14，机时近乎反比地缩短至原来的 3/14 ≈ 21%——在样品富余、机时稀缺的格局下，高重数标记是通量的杠杆。（b）T = 214.3 × 60 ≈ 12,860 min ≈ 214 h ≈ 8.9 天，与 t 同比例下降；机时对 t 的弹性为 1，对 p 的弹性为 −1。（c）会。梯度越短，色谱峰越窄、共洗脱越多，母离子隔离纯度与碎片采样数都受压；单细胞信号本就微弱，压缩采样时间直接侵蚀鉴定深度。现实的解法不是无限压缩 t，而是靠离子淌度、更快扫描与更高灵敏度的仪器在同样时间里采到足够碎片——这正是 2.6 节仪器前沿的动机。

本节以 nPOP 为样本，把一步法制备的机理、平台与规模讲清：

机理：转移损失按 xⁿ 复合，一步法把 n 压到 1，回收率上限不再随步骤数滑坡；代价是试剂必须互相兼容并与质谱兼容，nPOP 为此选用 DMSO 裂解、甚至省去还原烷基化；
平台：氟碳涂层玻片让液滴成球定位，压电分液按阵列布液、逐个挑细胞，湿度、露点与水圈协同控制蒸发，一片玻片容纳 504 个样品位；
规模与质控：1–2 天可制备 3,000 余个单细胞，空白液滴与载体通道共同构成批次底噪档案；通量上千之后，瓶颈转移到质谱机时，指向 2.5 节的采集经济学与 2.6 节的仪器前沿。

关键术语

一步法 (one-pot): 全部制备反应在同一容器同一份体积内完成、中途不转移不清洗的制备方式。
转移损失 (transfer loss): 样品在容器间转移时残留于壁面与液面的份额，多步流程下按 xⁿ 复合累积。
氟碳涂层 (fluorocarbon coating): 表面能极低的碳氟修饰层，使纳升级液滴成球、定位稳定、接触线短。
压电分液 (piezoelectric dispensing): 压电陶瓷驱动毛细管喷出皮升级液滴的非接触分液技术，可携带单个细胞。
声学移液 (acoustic dispensing): 以声滴喷射移出纳升级液滴的非接触分液技术，可用于试剂的阵列布放。
免清洗制备 (cleanup-free preparation): 只用与质谱兼容的试剂、从而省去除盐清洗环节的样品制备策略。
空白液滴 (negative-control droplet): 经历全流程但未落入细胞的液滴，其信号刻画试剂、溅射与残留构成的底噪。
残留污染 (carry-over): 前一样品经分液头、色谱系统等途径混入后一样品的交叉信号。
淬灭 (quenching): 以羟胺等试剂终止标记反应、消耗多余标签的步骤。
漏切率 (missed-cleavage rate): 酶解后仍含未切开位点的肽段比例，衡量酶解完全程度的指标。

参考文献与延伸阅读

Leduc A, Huffman RG, Cantlon J, Khan S, Slavov N. 2022. Exploring functional protein covariation across single cells using nPOP. Genome Biology 23: 261.
Leduc A, Huffman RG, Cantlon J, Khan S, Slavov N. 2024. Massively parallel sample preparation for multiplexed single-cell proteomics using nPOP. Nature Protocols（doi:10.1038/s41596-024-01033-8）.
Specht H, Harmange G, Perlman DH, Emmott E, Niziolek Z, Specht H, Harmange G, Perlman DH, Emmott E, Niziolek Z, Budnik B, Slavov N. 2018. Automated sample preparation for high-throughput single-cell proteomics. bioRxiv: 399774.
Petelski AA, Huffman RG, Specht H, Perlman DH, Slavov N. 2021. Multiplexed single-cell proteomics using SCoPE2. Nature Protocols 16: 5398–5425.
Zhu Y, Piehowski PD, Zhao R, et al. 2018. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10–100 mammalian cells. Nature Communications 9: 882.
Ye Z, Sabatier P, et al. 2025. Enhanced sensitivity and scalability with a Chip-Tip workflow enables deep single-cell proteomics. Nature Methods 22: 499–509.
Ctortecka C, et al. 2024. Automated single-cell proteomics providing sufficient proteome depth to study complex biology beyond cell type classifications. Nature Communications 15: 2474.
Specht H, Emmott E, Petelski AA, Huffman RG, Perlman DH, Koller A, Slavov N. 2021. Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2. Genome Biology 22: 50.
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Gatto L, Aebersold R, Slavov N, et al. 2023. Initial recommendations for performing, benchmarking and reporting single-cell proteomics experiments. Nature Methods 20: 375–386.