5.2 基准评测：DIA 信息学流程横评

5.2.1 为什么需要信息学基准

DIA 把隔离窗口固定铺满质量范围，低信号样本的覆盖由此做深，已进入单细胞常规（Derks et al., 2023；Ye et al., 2025；Sinn and Demichev, 2025）。

但第四章反复出现的事实在此同样成立：仪器产出的是一摞原始文件，定量矩阵由分析者的一连串选择制造出来。选择从谱图库(spectral library)开始——用同型仪器上的低输入样品实测建库、下载公开发布的现成库、用预测软件生成库，或者不建库走无库检索(library-free search)；接着选检索与定量引擎——DIA-NN（Demichev et al., 2020）、Spectronaut、PEAKS 各有算法；再往下是参数——FDR 阈值、定量设置、酶切特异性；矩阵出炉后还有填补、归一化、批次校正与差异检验（4.3、5.1）。图 5.2-1 把这条链画成一个三层组合空间：每个交点是一条候选流程，组合数按乘法增长。

组合空间大到没有哪个实验室能凭经验通吃，而各家方法论文自报的数字建立在各自的仪器、样品与默认参数上，口径互不相同——同样一句"定量约两千种蛋白"，在纳克级与单细胞级进样之间并不可比。要比出高下，就得把候选组合放进同一批数据、同一套指标之下，这正是基准评测(benchmarking)的用意。Wang 等（2025）对 DIA 单细胞信息学流程做了一次系统横评，本节以它为标本：目标不是记住结论——结论会随版本过时——而是学会解剖这一类论文：数据从哪来、比了什么、怎么计分、结论在什么条件下成立。

5.2.2 评测框架的解剖：数据、组合与指标

拿到一篇基准论文，先问三个问题：数据从哪里来？比的是哪些组合？用什么指标计分？三个答案合起来，就是结论的适用范围。

数据。Wang et al.（2025）的数据分三层。第一层是掺混标准品：HeLa 与酵母、大肠杆菌蛋白酶解物按设定比例混合，总上样约 200 pg，timsTOF Pro 2 上以 diaPASEF 采集、多配比各设重复——人为设定的混合比使比值准确性(ratio accuracy)获得真值(ground truth)。第二层是独立酶解的掺混蛋白组，跨两台仪器与多个批次，考察重复性与稳健性。第三层是真实单细胞：MCF-7（阿霉素处理与溶剂对照）经微流控 PiSPA 平台逐细胞制备，外掺酵母与大肠杆菌蛋白（约 20/40 pg），3 批共 60 样——真实细胞没有量的真值，但分组已知，从检索到差异检验的全链条在此受试。这些参照连同通用的模拟手段，构成图 5.2-2 的三类真值来源。

组合。受评引擎三个：DIA-NN（1.9.2）、Spectronaut（19.5；无库走 directDIA+，实测库走 Pulsar 建库）与 PEAKS Studio（12.0）。谱图库策略四种：无库、样本特异性 DDA 库（同型 LC-MS 上约 2 ng 进样反复累积）、公开发布的 bulk 级库（约 200 ng 进样、高 pH 分级）与 AlphaPeptDeep 预测的全蛋白质组库。

引擎与库策略构成检索层横评；矩阵之后另起一轮：填补 × 归一化 × 批次校正 × 差异检验，共排出 4,900 种组合。口径注记：论文未把运行效率纳入计分，不少基准研究将其列为指标，引用时须看清各自覆盖的维度。

指标。表 5.2-1 列出指标体系。覆盖类：每 run 定量的蛋白数，以及数据完整度(data completeness)——跨全部 run 均被定量的蛋白占比；精度类：重复样中蛋白强度的中位变异系数(median coefficient of variation, median CV)（式 5.2-1）。

准确性类：观测比值与设定混合比的偏差；下游类：已知条件下差异检验的精确率、召回率与 F1，批次校正以聚类与已知分组的一致性（调整兰德指数 ARI）计分；质控类：交叉物种夹带(cross-species entrapment)——样品里并不存在的物种，报出来即是假阳性，充当阴性参照。每个指标只照亮一个侧面：鉴定数不问对错，完整度不问可靠，CV 不问覆盖——表 5.2-1 的最后一列因此与定义同样重要。

5.2.3 多目标评测的读法：Pareto 前沿

横评结果不是一张排行榜，而是几张互相牵制的记分卡。统一口径下：Spectronaut directDIA 每 run 定量 3,066 ± 68 种蛋白，三者最高；DIA-NN 相当（共 3,061 种）而跨 run 共有比例较低（48%，即 1,468 种，Spectronaut 为 57%，2,013 种），缺失更多；但论定量精度，DIA-NN 的中位 CV 为 16.5%–18.4%，明显优于 Spectronaut 的 22.2%–24.0%；PEAKS 鉴定居中（2,753 ± 47），精度垫底（27.5%–30.0%）（Wang et al., 2025）。三个引擎各占一角，没有一个在所有指标上领先。

这不是巧合，而是结构性交换。要把更多蛋白写进矩阵，只能放宽信号门槛、容忍更边缘的峰群匹配；拉进来的恰是低信号蛋白，其测量噪声大、干扰重，CV 随之抬高；反过来收紧标准，矩阵变小变稳。覆盖与精度在低信号区相互争夺，指标因此互斥，单指标排名没有意义：按鉴定数排，Spectronaut 第一；按 CV 排，DIA-NN 第一——两个"第一名"都真，也都只说了一半。

"推荐流程"因此都是有条件的推荐：结论绑定数据类型、仪器采集与软件版本，条件一换，排序可能重排——适用边界在 5.2.5 系统展开，引用时把条件一并引上，结论才完整。

5.2.4 真值从哪里来：掺入、夹带与模拟

基准评测的一切指标都指向同一个难题：单细胞没有真值——没有哪种独立技术能告诉你某个细胞里某蛋白的确切分子数。横评只能从三种渠道构造参照（图 5.2-2）。

其一，掺入(spike-in)：把已知量或已知比例的外源物质加进样品，掺混标准品的物种混合比、真实单细胞外掺的酵母与大肠杆菌蛋白皆属此类。其二，交叉物种夹带：样品里没有的物种充当阴性参照。其三，模拟：从高输入数据稀释出"单细胞水平"的谱图，或按参数模型生成谱图——误差全部按写进模型的规则发生。

比值压缩(ratio compression)是掺入揭示的一类系统性失真。设两通道的分析物真量为 q 与 rq（真实倍数 r），另有强度 b 的背景信号（干扰、残留污染）向两通道等量注入，观测比值即式 (5.2-2)。b/q 越大，ρ 越向 1 收缩：上调被低估、下调被高估，差异分析的功效随之衰减。掺入的混合比已知，压缩程度便可逐工具量化——"比值准确性"一列的机理即在于此（表 5.2-1）。

模拟的便利正是它的风险：模拟只能测试你假设过的错误。生成模型若没有写进某种干扰——共流出、离子饱和、进样波动、载体残留——评测就对这类干扰视而不见，"工具 A 更稳健"只在模型假设的世界里成立。稀释模拟同样带着母数据的印记：高输入谱图的峰形、干扰与缺失结构未必是单细胞的样子。

Wang et al. 因此把掺混标准品、真实细胞与掺入设计并用来互相印证，而不是把评测押在单一数据来源上；5.5 节将把"评估用什么尺子"作为专题展开。论文里的一条教训可以直接救你的项目：把单细胞数据与高输入样品放在一起检索（共检索），会让样品中不存在的物种混进鉴定表，且这类假阳性靠强度阈值过滤不掉；把完整度阈值提高到 75%，能剔除其中的大部分（论文报告 10%–83%）。真值从实验设计里来，不从算法里来——这一原则对读论文与做实验同样适用。

5.2.5 结论的适用边界：场景、版本与口径

如实转述论文的推荐（均以原文为准）。引擎层面：DIA-NN 在各库策略下表现均衡、定量精度最高，且学术使用免费，是综合稳健的选择；Spectronaut directDIA 胜在鉴定数与完整度；PEAKS 鉴定居中而精度落后。库策略层面：条件允许时，用低输入样品构建的项目特异性库最有利；公开发布的 bulk 级库不占优势（对 Spectronaut 反而再现性最差）；现成模型预测的谱图库对单细胞无益——预测模型多数未经单细胞数据训练优化。就 DIA-NN 而言，公开库鉴定最多、无库定量最准；下游评测统一采用无库（Wang et al., 2025）。

矩阵之后的 4,900 种组合里没有普适冠军，但结构性规律清楚：稀疏性消减对结果影响最大，75% 完整度是"多保蛋白"与"少背填补负担"之间的合理权衡；批次校正环节 ComBat（参数与非参数两式）与 limma 稳定占优；差异检验环节 DESeq2 与 limma-trend 出现频率最高；掺混标准品上表现最好的组合是 SoftImpute 填补、Sum 归一化、ComBat-P 与 DESeq2，批次聚类的 ARI 达到 1.0。

论文的建议因此不是押注单条流程，而是并行分析一组高性能组合、审视结论的一致性。

引用以上任何一条，都要连同适用边界一起引用。其一，场景边界：全部评测在 timsTOF 平台、diaPASEF 采集、皮克级上样下完成，换仪器、换采集方式，排序不保证外推。

其二，版本漂移(version drift)：结论绑定 DIA-NN 1.9.2、Spectronaut 19.5、PEAKS 12.0——DIA 系软件一年数更，神经网络模型、干扰校正与评分策略都在演进，旧名次会随版本失效；引用时附版本号既是学术礼仪，更是准确性要求。其三，口径边界：评测未计运行效率，也未必覆盖你的关键指标（如肽段级比率、翻译后修饰）。社区白皮书要求基准结果连同数据、代码、参数与版本全链条公开（Gatto et al., 2023），正是让这三条边界可查的机制。把边界背下来，比把名次背下来有用：名次每版一换，读法长期有效。

5.2.6 把方法学到手：一次迷你基准

基准评测的方法不必等一篇论文，缩小规模就能在自己的数据上跑一遍：两条流程、三个指标。它的价值不在得出普适名次，而在为自己的数据积累一份可辩护的选择依据——为什么用这条流程，此处有账可查。

两条流程若在三个指标上互有胜负，迷你基准的产出就不是名次，而是一份诚实的认识：自己的数据上覆盖与精度如何交换、缺失集中在何处——这正好接上 5.1 的统计选择与 5.5 的评估之辨。

本节以 Wang et al.（2025）的横评为标本，把基准评测拆成可复用的读法：

• DIA 单细胞的信息学是组合问题：库策略 × 引擎 × 参数 × 下游四环节按乘法增长；口径统一的数据与指标是可比证据的前提（表 5.2-1）；
• 指标互斥是结构性的：覆盖与精度在低信号区相互争夺，正确读法是 Pareto 前沿而非单指标排名，"推荐流程"皆绑定数据类型、仪器与版本；
• 真值从设计来、不从算法来：掺入给比率与阴性参照，模拟只能测试假设过的错误，共检索与库规模会推高假阳性；
• 结论的寿命等于版本的寿命：引用附版本号与条件，并可用"两条流程 × 三个指标"的迷你基准在自己的数据上复核。

下一节把镜头从质谱数据转向基于流式与成像的细胞测量，看数千种处理组合如何系统导航（ANPELA）。