7.2 内标、外标与样品制备

定量标准首先需要身份、含量和不确定度的依据。标为分析纯的试剂，其标签范围不一定适合目标定量任务；一张只有相对峰面积的谱，也不能独立证明其质量纯度。有证标准物质(certified reference material, CRM)提供指定特性的赋值及相关计量信息，使用时仍要检查证书中的量定义、有效条件和样品处理要求。

BIPM 的 qNMR 内部标准资料按化合物讨论适用条件和限制。Nelson 等（2018）报道 NIST PS1 苯甲酸标准的建立，说明结构身份、同位素组成、不同测量程序和不确定度共同支撑赋值。引用这类工作不等于任何一瓶同名化合物都有相同纯度；实际使用的批次应有自己的证书或已建立的校准链。

一个合适内标应与样品和溶剂相容，能够完全溶解，在制备与测量时间内稳定，并有可可靠积分的报告信号。应检查其是否与待测物反应、改变酸碱状态、缔合或引起沉淀。没有明显的新峰不一定排除所有相互作用，加入前后位移、线宽和时间变化也可帮助判断。标准本身的光谱简单，只是选择条件中的一项。

称量便利和谱学便利可能不在同一个化合物上同时实现。易吸湿或挥发物的有效量会随操作变化，长弛豫的报告核会增加实验时间，位置合适的峰也可能与真实基质杂质重叠。应结合任务选标准并记录理由，保留标准证书、批号与储存条件，避免把别人某一溶剂中的经验直接当作当前样品的验证。

待测组分 A 的摩尔质量为 \(M_A\)，其报告峰与标准的积分及氢数分别为 \(I_A,N_A\) 和 \(I_S,N_S\)。由面积归一比得到 \(n_A\)，再乘 \(M_A\) 得到待测组分质量。最后除以原来称取的总样品质量，得到该样品中 A 的质量分数：

公式成立需要两组报告核具有经验证的可比响应，制样过程对样品与标准的相应量关系没有引入未校正改变。\(m_X\) 包含原样品中所有组分，不只是 NMR 可见有机物。若目的为干基质量分数，则需要定义并测量干基分母；不能先采用原样质量，再在结果接近预期时把它称为干基纯度。

教学例：称样 50.00 mg，标准材料 5.000 mg，\(w_S=0.9950\)，\(M_S=100.0\ \mathrm{g\,mol^{-1}}\)，\(M_A=150.0\ \mathrm{g\,mol^{-1}}\)。待测三氢信号积分 18.0，标准四氢信号积分 4.0，归一比为 \((18.0/3)/(4.0/4)=6.00\)。标准有效质量 4.975 mg，对应 0.04975 mmol；待测量为 0.2985 mmol，质量为 44.775 mg，故 \(w_A=0.8955=89.55\%\)。所有数值为教学设定，摩尔质量的小数位用于演示计算。

若省略标准纯度修正，把 5.000 mg 全当成有效标准，则本例得到 90.00%，高出 0.45 个百分点。若遗漏摩尔质量比，则会错误地把摩尔比例换成质量比例。逐步写出 \(n_S\)、\(n_A\)、\(m_A\) 和 \(w_A\)，比把一串数字直接输进软件更容易发现单位与定义错误。有效位数则应由最终不确定度决定，不由计算器显示长度决定。

定量转移不仅是把可见固体倒入管中。容器壁残留、溶解不完全、过滤吸附和沉淀会改变目标量。应观察溶液是否均匀，并根据方法确认必要的冲洗、平衡时间和温度。若取样前已有不溶物，NMR 只测上清液中的含量；是否能代表原称样组成，需要另有依据。峰形良好不能证明全部样品已经进入溶液。

内标与待测物在同一均匀溶液中时，求物质的量比通常不需要独立知道最终溶液体积；共同体积可约去。这一便利不消除差异性损失。混合后等比例取一份均匀溶液保留组成比，而标准或待测物选择性吸附、析出或挥发会改变比例。若先分别转移再混合，两者的转移完整性也需要检查。

对容易吸湿的原样，称量到溶解之间的时间可能改变总质量和有效含量。对挥发物，开口时间和容器密封同样重要。处理策略应服从被测量定义：测原样含量时保留原样状态，测干基含量时须采用适当干燥与水分测定，并检查干燥不会使目标分解或挥发。不能用未经验证的烘干步骤来使结果接近一百。

标准选择还应考虑报告信号的总强度，使其与待测信号处于合适范围。标准过量可能占用接收动态范围，量太少则可能使标准积分成为主要噪声来源。选择两个以上待测报告核可交叉检查，但它们共享同一称量和标准含量，不能把同一次制备的多个峰当成多份独立样品。

制样记录应把每一次添加与每一个分母对应起来：原样质量、标准质量或加入量、溶剂与体积定义、稀释倍数、最终取样份数、观察到的沉淀和等待时间。后来更换一条积分信号时，这些数据仍保持可用。若只有最终计算表没有制样链，得到一个小数很多的结果也难以追溯。

在简化外标模型中，标准谱建立面积归一与已知浓度之间的比例，未知谱使用同一或已校正响应换算浓度。两次测量的尺度、激发、充分弛豫及几何条件须相容。浓度转为原样总量时还需结合制样体积或相应质量模型。与内标相比，更多实验量需要在两次测量之间传递，方法必须用已知样品进行检验。

Wider 与 Dreier（2006）提出 PULCON，把不同溶液条件的绝对谱强度通过相关校准联系起来。其脉冲长度等信息参与响应传递，不能简化成任意外标面积直接相除。实际实施要按相应方法校准并验证；软件中的方法名字只说明采用了某种流程，不证明当前样品几何、弛豫与接收设置都满足其要求。

另一种做法把标准放在同轴管等隔离空间中，与样品同时检测。标准不与待测物混合，但两个空间的有效检测体积和接收权重仍不同，还可能受到磁化率差和几何偏差影响。应建立相应校准，不能仅因两个峰出现在同一张谱上，就把它们当作共溶液内标使用式（7.2-1）。

电子参照也需要可靠校准链。一个合成信号可以提供响应标尺，却没有由其名称自动给出样品物质的量；应说明它如何与已知标准联系，以及稳定性和应用范围如何验证。对外标方法，标准与未知之间穿插已知样品的检查可以揭示响应漂移，使跨谱量关系更易追踪。

对质量分数，记录原样总质量和标准有效量；对溶液浓度，记录定义的体积或质量浓度基准；对反应收率，明确基于哪一个起始物的理论量。几种结果可能由同一面积比推得，却使用不同辅助输入。将计算公式逐项映射到制样记录，可以提前发现缺少的体积、纯度或转移信息。

报告保留校准方式、参照身份和赋值来源、样品与标准加入量、报告峰及氢数、适用条件和计算结果。标准证书的不确定度、称量变化、面积比和响应校正都可能限制最终精度。下一节将补充所需统计基础，把这些输入统一到测量不确定度与方法验证中，解释为何重复性良好的数字仍可能存在偏差。