DOSY 从梯度衰减得到扩散信息
DOSY 提供扩散响应，不能只凭一条带就认定一种化合物。
读图时保留这项条件：聚集、交换、对流和重叠会影响结果，相近扩散系数也可能来自不同组分。
用两条扩散衰减构成一个重叠峰
改变扩散系数与配比，对照重叠响应在不同梯度权重下的表观系数。
7.6.1 从随机位移到可测的衰减
一条氢谱峰的频率描述化学环境，扩散实验则询问携带这些核的粒子在一段时间内移动了多少。溶液中的平移扩散来自随机热运动。在均匀、各向同性且无整体流动的简单情形，沿一个方向的平均平方位移与时间成正比，比例常数由自扩散系数决定。这里测量的是粒子运动，不能把它当作两颗氢之间的空间距离。
展开说明与推导
\(D\) 的单位为 \(\mathrm{m^2\,s^{-1}}\)。脉冲场梯度让不同位置的自旋获得不同相位；随后施加适当的解码梯度，静止粒子可以重新聚相，移动粒子因前后位置不同而留下相位差。大量粒子的相位相互抵消，使回波减弱。梯度越强、编码持续越久，在其他条件相同的情况下，扩散导致的衰减通常越明显。
扩散排序谱 DOSY 把一系列梯度实验拟合得到的扩散系数，作为氢谱之外的显示轴。该轴来自模型估计；它的分辨能力取决于实验误差和拟合条件，不能按普通频率轴的方式读取。
展开说明与推导
每个梯度点都有一张普通频率谱，同一峰在这些谱中的高度或积分构成衰减曲线。DOSY 并未把混合物物理分离。若某组分的多个孤立信号给出相容的扩散系数，可以据此帮助分组；若两个组分扩散相近，它们可能落在同一带内。后者仍需要上一节讨论的独有信号或其他实验约束。
7.6.2 使用正确的梯度权重
在单一自由扩散组分、梯度均匀、实验响应相容的模型中，信号满足指数衰减。把梯度序列的扩散加权统一写为 \(b\)，可避免将不同脉冲形状混为一谈。对于一对矩形梯度脉冲，常用表达式为：
展开说明与推导
\(g\) 为梯度幅度，单位 \(\mathrm{T\,m^{-1}}\)；\(\tau_g\) 为梯度持续时间，\(\Delta\) 为两梯度起点之间的时间，均以秒计。这里用 \(\tau_g\) 避免与化学位移符号混淆。\(\gamma\) 采用角频率约定，单位 \(\mathrm{rad\,s^{-1}\,T^{-1}}\)，不可把以赫兹表示的旋磁比直接代入同一公式。\(b\) 的单位为 \(\mathrm{s\,m^{-2}}\)，所以 \(bD\) 无量纲。
式中假设包括所用梯度波形。半正弦梯度、双极梯度和对流补偿序列具有各自的有效权重，应依据实际脉冲程序计算。探头显示的梯度百分比也不等于已经校准的物理幅度。若幅度尺度错了，拟合仍可能十分平滑，得到的扩散系数却会系统偏移。
梯度序列中还存在弛豫衰减。若各点的时间安排相同，它常被吸收到共同的 \(S_0\) 中；若改变扩散时间或其他延迟，则不能假定所有强度变化都由扩散造成。比较不同实验前需要说明响应如何归一，并核对相位、基线、峰宽和温度是否稳定。
低梯度参考也可能已经有扩散衰减，不能总把第一张谱等同于零梯度强度。若使用第一点归一，模型应写成 \(S(b)/S(b_{\min})=e^{-(b-b_{\min})D}\)，或者在原始幅度上把初始强度作为拟合参数。把非零第一点强行定义为零权重，会使衰减曲线和参数关系发生偏差。
7.6.3 一组可核验的衰减计算
以下为教学数据，不代表某种化合物的实测扩散常数。设组分 A 的 \(D_A=1.00\times10^{-9}\,\mathrm{m^2\,s^{-1}}\)，B 的 \(D_B=0.50\times10^{-9}\,\mathrm{m^2\,s^{-1}}\)，二者分别归一到 \(S_0=1\)。当 \(b=1.00\times10^9\,\mathrm{s\,m^{-2}}\) 时，A 的 \(bD=1\)，B 的 \(bD=0.5\)，剩余信号分别为 0.3679 和 0.6065。
| \(b/(10^9\,\mathrm{s\,m^{-2}})\) | A 的 \(S/S_0\) | B 的 \(S/S_0\) | 等初始贡献的重叠峰 |
|---|---|---|---|
| 0 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 |
| 1 | 0.3679 | 0.6065 | 0.4872 |
| 2 | 0.1353 | 0.3679 | 0.2516 |
展开说明与推导
对理想孤立峰，可由一个非零梯度点演示反求：\(D=-\ln(S/S_0)/b\)。A 在第二行给出 \(1.00\times10^{-9}\)，B 给出 \(0.50\times10^{-9}\)。实际估计需要多个点和误差分析，单点计算只说明量与单位如何对应；极小的剩余信号容易被噪声、基线和相位误差支配。
习题 7.6-1 · 两点教学估计
某孤立峰在 \(b=2.00\times10^9\,\mathrm{s\,m^{-2}}\) 时剩余归一信号0.367879。按单指数模型求扩散系数。
参考解答\(-\ln(0.367879)\approx1\)，故 \(D=1/(2.00\times10^9)=0.50\times10^{-9}\,\mathrm{m^2\,s^{-1}}\)。结果依赖正确的 \(S_0\)、梯度权重和单组分假设，应以完整衰减序列验证。
7.6.4 拟合曲线与误差一起读取
实践中可对原始幅度进行非线性最小二乘拟合，联合估计初始强度和扩散系数。取对数后虽然直线斜率为 \(-D\)，误差性质却改变：低强度点的相对误差显著增加，零值或负值也不能取对数。不能只因直线图容易画，就默认所有对数点具有相同可信度。
展开说明与推导
选择梯度范围时，需要既有足够衰减又有足够信号。所有点几乎不衰减时，曲线斜率难以确定；大部分点进入噪声时，同样缺乏有效信息。先做少量梯度点的试验，再调整范围，往往比盲目增加末端强梯度点更有价值。梯度点的安排、每点扫描数与总时间共同影响估计精度。
检查残差时，应看它是否随梯度强度或采集顺序系统变化。末端持续高于预测可能来自重叠的慢扩散组分、背景偏置或模型偏差，不能仅凭这一现象认定聚集。独立重复可区分部分随机误差与可重复偏差，但不能代替对脉冲程序和样品条件的检查。
DOSY 图中的扩散带宽常由拟合不确定度构造。一个弱峰的带更宽，可能只是扩散系数估计较差；不能直接称它具有更宽的粒径分布。若软件采用其他显示规则，应先读清其定义。
展开说明与推导
同一分子的孤立信号应在误差范围内支持相容的扩散系数。若只有一条拥挤峰给出异常值，先核对峰重叠、积分窗口和信号质量。报告时保留各峰拟合结果与不确定度，再说明分组依据；把它们强制放到同一条水平线上，会掩盖识别模型错误所需的信息。
整套数据应保存为频率与梯度点的幅度矩阵，保留每个点的实际梯度权重。取峰高时，线宽变化会影响幅度；取积分时，窗口、基线和邻峰又会产生影响。可以比较两种报告方式是否支持相同衰减，但需说明采用的方式，不能混用某些点的峰高和另一些点的面积。
采集顺序也具有诊断价值。若样品在实验期间发生反应、挥发或温度漂移，按递增梯度采集时，时间变化可能与梯度衰减混在一起。合理交错顺序或重复参考点，可帮助发现这种变化。发现漂移后应先解决样品和采集稳定性，再评价扩散拟合。
7.6.5 重叠峰为何产生表观扩散系数
若 A、B 在某频率处重叠，其幅度为两项指数之和，而不是天然的一个指数。沿用表7.6-1且初始贡献各半，总信号为 \(S/S_0=0.5e^{-bD_A}+0.5e^{-bD_B}\)。在 \(b=10^9\) 时，用单点反求得到表观系数约 \(0.719\times10^{-9}\)；在 \(b=2\times10^9\) 时约为 \(0.690\times10^{-9}\)。改变所用范围，估计也会改变。
展开说明与推导
差异来自快扩散贡献先被削弱，较强梯度下慢扩散贡献占比提高。有限范围内，这条曲线可能看起来很像单指数。双指数拟合虽然形式上能写出两个系数和两个幅度，实际却要求足够信噪比、足够曲线差异及可靠初值；当两个系数相近时，参数之间可强烈补偿。
展开说明与推导
更稳妥的路径是先用 A、B 的孤立峰估计各自扩散系数，再检验重叠峰是否能由这两个已知衰减共同解释。这样能减少未知参数，并与普通氢谱的组分证据相互核对。若没有孤立信号且衰减差异不足，结论应保留不可分辨性，不能把优化程序输出的两项自动作为两个已确认组分。
拟合得到相近的两个系数时，应检查参数不确定度及相关性，并改变初值验证解是否稳定。两个幅度互换、一个贡献趋近于零或系数随范围大幅移动，都提示分解缺乏稳健约束。此时报告单一表观衰减及其限制，比给每项命名一个未经确认的结构更符合数据。
习题 7.6-2 · 同一扩散带能否证明同一分子
两条孤立峰分别拟合为 \(0.80\pm0.05\) 与 \(0.82\pm0.06\)，单位均为 \(10^{-9}\,\mathrm{m^2\,s^{-1}}\)，误差为标准不确定度。能否据此确认二者属于同一分子？
参考解答数值在误差范围内相容，只支持共同扩散行为。两个不同分子也可具有相近扩散系数，结合或交换还会改变观察结果。应增加 COSY、HSQC、其他独有峰或分离后的比较，不能由相容性直接推出同一分子。
7.6.6 对流、聚集与交换的边界
扩散是随机运动，对流则是样品的整体流动。温度梯度、加热和样品几何可使流动对相位产生额外影响，导致异常衰减或位置偏差。温度设定到达某值并不保证液体已经均匀稳定。需要检查平衡时间、温控条件和适合样品的对流补偿方案，并保留脉冲序列信息。
展开说明与推导
扩散还依赖溶剂黏度和温度。简单球形粒子的 Stokes–Einstein 关系写为 \(D=k_{\mathrm B}T/(6\pi\eta R_h)\)，其中 \(R_h\) 为流体动力学半径。该关系可以解释在相同介质中较大的粒子往往扩散较慢，但实际分子具有形状、溶剂化与相互作用，不能从一个扩散系数直接套出唯一分子量。
浓度升高时扩散变慢，可能与聚集有关，也可能与溶液黏度变化有关。可做浓度系列，在相容温度下比较适当参照和多个报告峰，再结合位移、线宽与其他方法。参照自身若参与结合或受到不同微环境影响，也不能完整校正样品变化。应说明参照的作用及其适用条件。
若核在自由态与结合态之间交换，扩散时间内可能经历不同运动状态。极快交换的简单极限可接近群体加权的有效扩散行为；中间交换与具体序列则可能需要交换模型。单指数拟合所得数值可以作为条件明确的表观量，不能未经验证就解释为某一个纯状态的扩散常数或结合比例。
可以改变扩散时间检验模型，但每个时间点都要使用对应权重，并考虑弛豫和信噪比变化。观察到时间依赖，说明自由扩散单指数模型可能不足，原因还可能包括受限运动或实验偏差。应结合样品的物理背景判断，避免把同一个异常现象同时当作多种机制的确证。
图中水平切片可辅助查看某个扩散范围的频率信号，切片宽度却会影响保留下来的峰。切得很窄可能漏掉不确定度较大的同组分信号，切得很宽又会混入邻近组分。分析时返回各峰原始衰减与误差，而不只依据显示图上的颜色或切片后的峰数作结论。
先判断哪些信号具有相容的衰减，并核对重叠和误差；再讨论这种共同运动是否来自同一分子、结合、交换或偶然相近的大小。后一步需要额外证据，尤其要控制温度、黏度和浓度。
展开说明与推导
正式报告应列出溶剂、浓度、温度、梯度序列、扩散时间、梯度持续时间、校准依据、梯度点安排、峰的选择、拟合模型和残差检查。GNAT 等工具可以帮助处理扩散数据，但处理软件不会补回未测到的区分信息。选择性解析将在下一节继续讨论。
习题 7.6-3 · 梯度校准的系统误差
实际梯度幅度是分析时假设值的1.10倍，其余时间参数正确。按单指数模型拟合得到的扩散系数会怎样变化？
参考解答因为 \(b\propto g^2\)，真实 \(b\) 为假设值的 \(1.10^2=1.21\) 倍。观测为 \(e^{-1.21b_{\rm assumed}D_{\rm true}}\)，故用假设权重拟合得到 \(D_{\rm fit}=1.21D_{\rm true}\)，高估21%。更多重复主要降低随机误差，不能消除这项校准偏差。
关键术语
- 自扩散系数
- 描述随机平移运动随时间积累的系数。
- 脉冲场梯度
- 在空间上编码自旋相位的短时磁场梯度。
- 扩散加权 \(b\)
- 由实际梯度波形和序列时间决定的权重。
- DOSY
- 以拟合扩散系数组织信号的谱显示方法。
- 单指数拟合
- 将一个报告信号视为单一扩散响应的模型。
- 多指数拟合
- 尝试分解多个扩散贡献，需要更强数据约束。
- 对流
- 可干扰随机扩散测量的整体液体流动。
- 流体动力学半径
- 与溶剂中运动阻力相关的有效尺度。
- 表观扩散系数
- 在指定模型和测量条件下得到的有效估计。
参考文献与延伸阅读
- Stejskal, E. O.; Tanner, J. E. (1965). Spin Diffusion Measurements: Spin Echoes in the Presence of a Time-Dependent Field Gradient. J. Chem. Phys. 42, 288–292. DOI。梯度扩散测量的原始基础。
- Morris, K. F.; Johnson, C. S., Jr. (1992). Diffusion-ordered two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy. JACS 114, 3139–3141. DOI。
- Guest, J.; Kiraly, P.; Nilsson, M.; Morris, G. A. (2021). Signal-to-noise ratio in diffusion-ordered spectroscopy: how good is good enough? Magnetic Resonance 2, 733–739. 原文。用于理解噪声、拟合不确定度和系统误差的限制。
- Castañar, L.; Dal Poggetto, G.; Colbourne, A.; Morris, G. A.; Nilsson, M. (2018). The GNAT: A new tool for processing NMR data. Magn. Reson. Chem. DOI；项目说明。扩散数据处理的工具例。
- Claridge, T. D. W. (2016). High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry, 3rd ed. Elsevier. 出版社。DOSY 与样品条件的系统背景。