7.9 代谢组学与统计分析

矩阵的行可对应生物样品，列可对应谱点、积分区间或经验证的代谢物量。谱点、分箱面积与浓度具有不同解释范围。一个拥挤区间可能包含多个代谢物，一个代谢物又可能贡献多列；列数因此不等于已识别代谢物数，更不等于独立化学信息的数量。

样品表应保留对象编号、取样条件、制样批次、采集顺序、仪器、温度、酸碱状态和处理版本。贮存、提取、缓冲和水抑制会影响所见谱图。方法具有可重复性，也不能自动保证采样过程代表目标总体；实验设计与测量质量必须一起检查。

可加入过程空白、适当参照、重复测量和混合质量控制样品，分别检查污染、响应与漂移。质量控制样品来自多份样品的混合时，具有平均背景，不能保证每份极端样品都表现相同。排除异常样品的规则应有明确依据，避免仅因某点不符合预期分组而删除。

对齐尝试让具有相同归属的局部峰处于可比较位置。它可以减少小位移对固定区间积分的影响，也可能错误合并邻峰或抹去真实状态变化。应先核对同一代谢物的多个信号和局部网络，限定移动范围，保留未对齐原谱及实际移动量。对齐不应被用于强迫所有样品都符合某个候选。

分箱将连续谱分成区间并积分，减少列数且降低小幅移动的影响。固定箱边界若切开多重峰，峰稍移就会在相邻箱间转移面积。可采用与峰范围相容的区间，或经过验证的峰拟合；选择时需要说明边界和算法，不应只留下无法追溯到谱图的匿名矩阵。

水、抑制带和污染区间可按明确规则排除，其范围要随实验条件核查。宽背景和负基线会影响归一化与对数变换。缺失值也有不同来源：未检测、低于检出能力、拟合失败和真正不存在不应统一写成零。填补缺失的规则应进入后续验证流程。

盲目对每列取对数或加同一个小常数，可能放大接近零的噪声并改变距离。变换可以用于改善分布和尺度，但要说明采用方式、适用范围及零值处理。对既有正负谱响应的列，先判断数值来源，再选择与其含义相容的统计处理。

教学例：样品甲三个区域面积为 \((40,30,30)\)，总面积100；样品乙为 \((40,30,70)\)，总面积140。前两个区域的原始响应没有变化。总面积归一化后，第一区域由0.40变成 \(40/140=0.2857\)，相对下降28.57%。这项下降来自分母增加，不能直接解释为第一区域代谢物量减少。

\(i\) 为样品，\(j\) 为区域，\(\mathcal R\) 为纳入总面积的区域集合。更改排除区间也会改变分母与所有结果。相对组成存在总和约束，一列增加可使其他列的份额降低，所以解释相关与差异时需要知道这种共同约束。

概率商归一化 PQN 用样品与参照之间的响应商分布估计稀释尺度，常以其中位数作为代表。教学参照为 \((10,20,30,40)\)，样品为 \((20,40,60,100)\)，四个商为 \((2,2,2,2.5)\)，中位数2。除以2得到 \((10,20,30,50)\)，前三项吻合参照，第四项保留了不同响应。

此例依赖大部分有效响应能提供共同尺度的假设。若大量代谢物同步变化，或参照、噪声和排除范围不合适，估计的尺度也会偏移。Dieterle 等的原始工作提出了这种方法及其相对总面积法的用途；它不是独立确定所有真实浓度的测量。

设四个教学样品的两个特征为 \((1,1),(2,2),(3,3),(4,4)\)。两列均值均为2.5，中心化后样品沿同一条对角线排列。第一主成分单位方向可取 \((1,1)/\sqrt2\)，得分为两个中心化数值的和除以 \(\sqrt2\)。四个得分约为−2.121、−0.707、0.707、2.121。

这个完全共线模型中，PC1 解释100%方差，垂直方向没有方差。它没有用样品标签，也没有证明任何处理产生因果效应。实际得分图中的分离可能来自目标差异，也可能来自批次、稀释或制样；先查看载荷、原谱与元数据，再提出解释。

载荷描述特征对主成分方向的贡献，得分描述样品在该方向上的位置。一个较大载荷的箱可能包含多个化合物，不能直接命名为一个通路。主成分方向整体改变符号后，模型等价，因此正负号本身不具有固定生物意义。

单位方差缩放使每列具有相同方差尺度，可能提高小量级特征的影响，也可能放大不稳定噪声。未缩放时强峰可能主导方差。应依据任务比较处理选择，保留合理敏感性分析，不能只挑选使两组分离最漂亮的缩放图。

可在制样与采集阶段随机化并适当平衡组别，穿插质量控制样品和重复参照，记录采集顺序。随机化减少系统混杂，却不保证每种小样本因素恰好平衡；仍应检查元数据。若样品必须按特定顺序处理，应说明限制并在解释中考虑。

检验质量控制样品的漂移、峰宽、位移与量响应，可以发现部分仪器问题。生物样品中的基质变化可能与质量控制样品不同。校正后再次检查原谱和主要报告量，避免把真实变化一并扣除，或把不适合模型的样品强行压到同一分布。

数据泄漏发生在测试信息进入训练过程时。先在全体样品上按标签筛选差异箱，再交叉验证分类器，会把测试标签的作用藏在筛选中。正确做法是在每个训练折内执行筛选、估计跨样品处理参数和调参，再把冻结的流程应用到验证折。

同一对象的多时刻样品或重复谱若分散到训练与测试，模型可能识别对象特征而非目标规律。应按对象或任务所需更高层级分组划分。确定规则的单样品处理可以独立应用；用全体样品估计的共同参考或变换参数则需要检查是否引入测试分布信息。

置换标签可帮助判断流程是否利用了超出偶然的关系，但置换方案须保持适当的组内结构，且不能替代外部验证。大量尝试之后只报告最好一次结果，同样会造成选择偏差。保留预定任务、数据划分、候选流程和最终评价，有助于明确证据范围。

Sumner 等提出的化学分析报告框架强调制样、测量、质量控制、指认和处理资料。报告时区分经标准支持的身份、暂定注释、化学类别和未知信号，并列出实际使用的证据。证据等级反映身份确定程度，不能自动证明观察差异具有某种因果机制。

差异大小与其误差应一起报告，不能只按显著性排名。若同时检验许多特征，还需考虑多重比较；多个箱来自同一代谢物时，也应说明关联。生物解释可以提出后续验证问题，但不得把一次谱图统计关联直接写成已确认的通路机制。