5.5 TOCSY

5.5.1 总相关首先约束自旋系统归属

读完 COSY 后，常见的困难是已经找到几对耦合氢，却无法把拥挤区域中的信号分成可靠片段。总相关谱(total correlation spectroscopy, TOCSY)在两个氢化学位移坐标之间给出相关，其主要用途是识别可经标量耦合网络相互传递磁化的信号。读者应已掌握第 4 章的脉冲、弛豫和强耦合概念，以及5.3 节的二维坐标与5.4 节的 COSY。本节要求把相关峰整理成自旋系统，区分系统归属与直接耦合，并为缺峰记录实验条件。

本页统一采用5.3 节的坐标口径：F₁ 为纵轴、F₂ 为横轴，相关坐标按 (F₁,F₂) 次序记录；大 ppm 位于上方和左方。下文固定起点的 F₁ 位移，再沿 F₂ 读取相关对象。

自旋系统(spin system)在这里指在所用耦合模型中由标量耦合连接起来的一组核；实际 TOCSY 能否检出整组关系还受实验条件限制。若 A 与 B 有耦合，B 与 C 也有耦合，TOCSY 可以出现 A 与 C 的交叉峰，即使 A 与 C 的直接耦合(direct coupling)为零。这个峰支持 A、B、C 属于同一可传递网络；它本身不能证明 A 与 C 相邻，也不能规定两者之间隔着几根化学键。Davis 与 Bax（1985）的原始研究明确描述了这种经中间核形成的接力相关(relayed correlation)。

“总”说明实验能显示直接与接力关系，不保证一次采集就检出系统内所有组合。也不能把整分子当作一个系统：同一分子的两个片段若缺少有效的氢—氢传递路径，TOCSY 中可能分开出现；不同组分则可能因偶然重合而看似相连。这个边界决定了记录方式。峰表应写“与 A 同属候选系统”，不能直接改写成“A 所在碳与 C 所在碳成键”。TOCSY 的早期方法由 Braunschweiler 与 Ernst（1983）提出，书目信息可由ETH Zürich 的 Ernst 论文目录核对。

5.5.2 等向混合为什么产生接力相关

TOCSY 在编码间接维化学位移之后，插入一段用于磁化传递的射频照射。混合时间(mixing time)记为 \(\tau_{\mathrm m}\)，通常用 ms 表示。这一阶段常用自旋锁定(spin locking)及复合脉冲序列来实现等向混合(isotropic mixing)：适当的射频照射减弱不同位移造成的有效频率失配，使标量耦合能够驱动核间磁化交换。这里的“等向”描述混合阶段的有效相互作用，不是说各个核的化学环境变得相同，采集后的峰仍在各自位移位置。

可以把 A 起始磁化的一部分先传到 B，再经 B 传到 C；这只是便于读谱的路径描述。真实多核系统在混合期共同演化，传递效率由整套耦合、偏置和弛豫决定，不能把每一步当作固定概率的独立过程。Bax 与 Davis（1985）在MLEV-17 原始论文中指出，消除或匹配有效频率项有助于磁化传递，并说明较长混合期可产生多级接力关系。即使没有实际激发一条单独的 A 峰，二维编码也能在频率域区分以 A 位移为起点的相关。

混合序列的名称须与数据一起保存。MLEV-17 与 DIPSI-2 都是常见方案，不能只凭名称假定它们在任意位移跨度上效率相同。Rucker 与 Shaka（1989）的DIPSI-2 研究讨论了液体中耦合系统的宽带同核交叉极化。对本节解谱任务，所需结论是传递有有限的有效带宽：远离射频载频的信号可能传得较差。有关有效哈密顿量的完整推导留到9.4 节。

5.5.3 从三组峰逐步建立片段

第一步先回到一维谱，以每组多重峰中心标记位移，不把多重峰内的各条谱线当作新的环境。A、B、C 的积分和为 7，表示所列非交换氢的相对计数。表中三组信号压缩表示氢组，没有把每个核单独列出；一组 CH₂ 的两个氢若在真实样品中可分辨，就应拆成两个标签。共用一个峰位置也不能据此证明磁等价。

第二步读取 COSY 的 A—B、B—C 两对关系。在耦合路径解释可靠的前提下，可以提出链式片段的候选，但尚不能排除远程耦合或重叠造成的替代解释。第三步在 80 ms TOCSY 中固定 A 的间接维位移，沿另一维查到 B 与 C。再分别以 B、C 为起点核对其相关集合，并检查对应交叉峰是否围绕对角线成对出现。这样建立的是包含 A、B、C 的候选自旋系统；对称峰是同一相关的两处坐标表现，不能当作两条独立连接。

第四步才把系统归属与积分、位移合并。A 的 2H 信号位于较去屏蔽区域，B 为中间 2H，C 为较高场 3H，且 COSY 支持 A—B—C，符合含有 O—CH₂—CH₂—CH₃ 片段的候选。这里的氧取代解释仍依赖分子式和其他官能团证据，位移本身不能唯一认定氧原子。A—C 的 TOCSY 峰提高了 C 归入该片段的可信度，却没有在两端碳之间增加一根键。片段之外仍可能有其他原子或可交换氢，7H 不能直接写成整分子的氢数。

峰计数可以检验是否重复记录。若一个系统有 \(n\) 个可区分的信号位置，理想情况下所有两两总相关都可见，且不把多重峰细结构另计，则不同的非对角相关对数为：

其中 \(N_{\mathrm{pair}}\) 为无量纲的相关对数，\(n\) 为信号位置数，不是原子数。每个位置与另外 \(n-1\) 个位置配对，再除以 2 去掉重复。本例有 3 对，即 A—B、A—C、B—C；二维图上对应 6 个交叉峰位置，加上 3 个对角位置共 9 处。这个计数只是简化示意的上限，缺峰、重合或展开的多重峰细结构都会改变实际可数的峰数。

5.5.4 混合时间影响可见性，不能充当键数尺

短混合期通常使直接关系较突出，增加混合时间则可能使接力峰达到可检测强度。这是时间依赖的传递行为，不能把“80 ms 出现”转换成固定的键数。路径上耦合较小的某一步可能成为传递瓶颈；另一个核的偏置较大或磁化衰减较快，也可能让相同路径长度的相关表现不同。旋转坐标系弛豫(rotating-frame relaxation)描述锁定磁化在混合期间的衰减，是长混合期不能无限提高信号的原因之一。

表 5.5-1 的 A—C 在 20 ms 下未检出、80 ms 下可见，符合经 B 接力的解释。这只是设定中的相容证据，并未独立排除很小的 A—C 直接耦合。理想两核模型中的磁化传递会随时间振荡，多核系统更加复杂，因此任意一条交叉峰也不保证随着混合时间单调增强。Bax 与 Davis（1985）讨论的弛豫及偏置限制正是比较混合期时需要保留的条件。

比较两张真实谱时，应先确认相同溶剂、温度、载频、混合序列和处理方法，并检查显示等高线的门槛。自动归一化后的两幅图可能掩盖整体信号衰减；降低等高线还会把噪声误当作新峰。交叉峰检出阈值(cross-peak detection threshold)是认定峰可见的强度或信噪依据，须与“未检出”一起记录。只在一张图上看见淡点，且对应位置呈条带、拖尾或不稳定，不能作为传递建立的证据。

“A 与 D 没有峰”比“A 与 D 属于不同系统”弱。尤其在长链或含很小耦合的片段中，若中间一步受阻，远端信号会全部缺失。同一分子的无氢碳、羰基或杂原子附近常缺少有效的质子传递途径，但不能用一条普遍规则宣布跨越这些位置必定失败。可交换 OH、NH 的展宽与交换也会影响路径。实验决策应先检查失败原因，再考虑调整条件或换用提供不同约束的实验。

Oxford 的现代 NMR 实验指南还说明较长自旋锁定可能引起样品升温，并受探头条件限制。实际可用时间和功率由本地校准及实验室要求决定；指南中的仪器参数不能原样当作所有设备的设置。

5.5.5 重叠信号不应成为合并系统的依据

TOCSY 的优势之一是可以从较孤立的信号起点寻找拥挤区中的同系统信号。锚点信号(anchor resonance)是位移可可靠识别、能作为追踪起点的信号。如果两个系统中各有一个核在相同位移附近，直接把该位置当作一个节点，会把两个无关的网络错误合并。重合发生在频率坐标上，不能证明核之间有传递路径。

设两个教学系统为 A—B—C 与 D—E，其中 B 和 E 的峰重合在 1.60 ppm。以孤立 A 为起点可见该区域和 C，以孤立 D 为起点只见该区域。此时应保留“1.60 ppm 至少可能含 B、E 两个贡献”的标签。不能把共用位置转写成 A 与 D 同系统，也不能要求 A—D 长混合期相关必定出现。若整条重合截面同时含有 A、C、D，那可能只是两个起点贡献的叠加；真正的同系统检验仍须从分辨开的起点进行。

检查还包括峰形和坐标。二维峰由多条谱线组成时，同一信号中心附近会有多重峰结构；对角拖尾则可沿行列延伸。两维数字分辨率不同，镜像相关的轮廓与高度可能不同，因此不能把外观严格相同作为唯一判据。若一次拾峰把同一多重峰中的几个轮廓各记成节点，自旋系统规模会被夸大，上一节的相关对数也会失去意义。应先在一维谱中定义信号标签，再把二维局部轮廓归到这些标签。

选择性一维 TOCSY 可以从孤立信号出发取得相关子谱，但选择脉冲若同时覆盖两个起点，也会返回混合的系统贡献。5.9 节将讨论选择带宽和串扰。本页只要求在二维指认表中保留重合歧义，并考虑改变溶剂、温度或增加另一种坐标证据。改变条件后的位移变化须重新匹配标签，不能把新旧 ppm 值机械对应。

5.5.6 把系统归属写入结构证据表

整理 TOCSY 时，证据表至少区分信号位置、系统标签、相关对象与解释条件。若 COSY 支持 AB、BC，TOCSY 支持 ABC 同系统，就分别记录这两种约束；不能把 TOCSY 的三对关系全部灌入直接成键表。连接方式不同的链、支链或环，可能在充分传递后都呈现相同的两两总相关集合。系统内部的排列要回到直接耦合、积分及结构限制判断。

当已经有分子式时，可以核对该系统所含的相对氢数是否与候选片段一致，并检查未指认信号。一个未列入系统的孤立单峰可能属于分子中另一个片段，也可能是杂质；“没相关”不能替代身份判断。若目标是把氢组对应到碳位点，下一页的HSQC 与 HMQC提供另一类坐标约束；若要跨越没有有效质子网络的位置，再考虑HMBC，其缺峰同样需要条件说明。

最后保存实际使用的混合序列、各混合时间、载频、温度和处理阈值，并注明哪些相关仍可能受重叠影响。对表 5.5-1，可以提交“ABC 候选系统，COSY 为 AB、BC，80 ms 下出现 AC 接力相容峰”的记录，再附 O—CH₂—CH₂—CH₃ 片段假说与尚需核对的分子式。后续证据若与该假说不符，就回查峰归属和路径解释。