9.11 主动选择补充实验

如果分歧是相邻质子是否属于同一耦合路径，优先考虑 COSY 或有针对性的去耦、TOCSY。若已有局部片段而连接位置不同，可考虑 HMBC；若连接一致、相对构型或构象不同，可考虑 NOE/ROE 及耦合分析。变温实验适合判断状态交换和条件依赖，但温度改变也可能影响溶解度、质子化及样品稳定性，需要这些条件控制。

候选差异表应同时列出预期结果、观测所需的信号、可能的重叠和检测条件。例如“候选甲预测 Hₐ 与 Hᵦ 存在可检测标量关联，候选乙不预测这一直接关联”比“COSY 能确认甲”更可审查。前者允许检查弱耦合、长程耦合或谱质问题；后者把待检验结论提前放进实验目的。

HMBC 借助长程异核耦合补足片段连接，是原始多键关联研究及有机结构核磁方法的关键工具。其响应依赖具体耦合及优化条件，不是一个对所有二键、三键通路都必然点亮的探测器。预期关联未见时，先检查信号、耦合范围、重叠和检测灵敏度；不把未见峰直接变成不存在连接的硬约束。

HSQC 可先解决哪个氢连在哪类质子化碳上。如果候选的区别只是一个乙基位于氧侧还是碳链侧，碳位移及直接氢碳归属往往比更多未归属氢峰有用。位移仍是条件相关的证据，应与整体连接和远程关联共同判断。选择实验时可以先减少归属歧义，再检验关键连接，不必每次都直接追求排除候选。

例如两种连接方案把同一片段接到不同的非质子化碳 Cₓ 或 Cᵧ。可先核对两碳是否分辨，再选该片段上有适当长程通路的氢作 HMBC 目标。若 Cₓ 与 Cᵧ 恰好重叠，即使新增了关联也可能仍不能区分；此时改变条件以分开碳信号，或选择另一条独立通路，才会增加有效信息。目标坐标和分辨率需求应在采集前写出。

NOE/ROE 回答空间信息，需要考虑构象群体、运动、选择性和混合时间。定量 NOE 研究展示了在明确条件下处理柔性体系的方式，不能据此假设任何一次照射都能给出单一距离。若两候选的差异涉及相对面关系，应挑选受构象影响较小且能清楚照射的位点，并安排对照和多个相关约束。

变温则可检验峰合并、分裂或群体变化是否与交换模型相符。升温后两个峰合并，既可能是交换加快，也可能只是位移接近；应比较线形、积分、可逆性及其他信号。实验前保留每个候选对温度行为的具体预测，温度变化后重新核对样品状态，不沿用室温下全部假设。

先假设实验结果完全可靠。实验甲将候选分成“甲、乙”和“丙、丁”两组，两个结果各半；不论哪组出现，剩余两个等权候选的熵均为一 bit，所以期望增益为一 bit。实验乙把前三个分为一组、丁单独一组，结果概率分别四分之三与四分之一；剩余熵为四分之三乘 log₂3，即一点一八八七 bit，增益约零点八一一三 bit。

实验丙能产生四个互不混淆的结果，各对应一个候选，理想增益为二 bit。它在信息量上最强，却可能耗时最多。这个计算只是候选分组模型；不能因为一张表把 HMBC 写成四组，就断言真实 HMBC 能确定四个候选。必须由具体候选对实验响应的预测构造结果类别。

若已有证据使候选权重不等，初始熵和各结果概率都要重算。等权结果的排序不能直接沿用；应说明权重来自何种实验、模型或人为设定，并检查改变权重后首选实验是否稳定。对缺少校准的模型打分，可先报告等权与几种合理权重的情景，避免把一个任意先验隐藏在“最优实验”的名称里。

Lindley 的信息设计研究和贝叶斯实验设计综述提供了这种把实验选择写成期望效用的统计背景。在核磁中，效用也可直接是能否核对关键连接、避免错误结构或减少人工归属。选择熵并非唯一目的，必须与实际科学问题一致。

若观察阳性，甲的后验权重为零点四除零点四二五，约百分之九十四点一二；若观察阴性，甲的权重为零点一除零点五七五，约百分之十七点三九。阴性降低甲的权重，却没有把它降到零，因为模型容许漏检。按两种结果加权，期望后验熵约零点五二零五 bit，增益约零点四七九五 bit；数值由本节计算脚本给出。

真实实验中，漏检和假阳性不是任意固定常数。它们随耦合、峰重叠、信噪比、选择性和处理改变；多条关联的错误也可能相关。若不能可靠估计响应概率，可先采用范围或情景分析，比较乐观和保守设定是否选择同一实验。不可把神经网络的未校准分数直接填进概率模型，再把小数点精度当成实验设计的确定性。

实际时间包括调谐、匀场、脉冲校准、稳定温度、采集、处理和重新归属。一个选择性一维实验可能更快，但峰重叠时不够选择；一次二维采集耗时较长，却能同时处理多项连接歧义。对低浓度样品，弱长程关联可能需要很长时间；先浓缩、调整探头或选择更灵敏的直接关联，可能比增加候选生成次数更有效。

成本还包括样品量、分离与回收、稳定性和改变条件的可逆性。变温、换溶剂或加入试剂后应确认样品仍对应同一问题。微量天然产物可能更重视保存样品；反应监测可能更重视时间分辨。把这些成本单独列出，必要时采用约束而非强行折算成同一个数字。

结果更新时应把观测与解释分开。例如先记“指定坐标有交叉峰，信噪与对照合格”，再记“支持候选甲的这条长程通路”。如果峰仍重叠，就保留范围而不是完整指认。多个新证据共用同一归属或同一个谱，不宜当成完全独立的支持相乘；否则可能把一次错归属放大成很高置信。

可在报告中写下下一实验的停止条件：关键连接满足、候选仍多于一个、出现全部候选不能解释的峰，分别如何处理。最后的结构报告给出已解决的连接、剩余构型或构象歧义，以及最有价值的下一项实验。这样即使暂时不能给唯一答案，也能把研究推进到具体可执行的位置。

若要评价自动选择程序，应在运行前隐藏待补实验的答案，保存当时候选和选择理由，再揭示相应结果。已经看过完整谱后挑出最有区分度的一张，可用于教学说明，却不算前瞻性的主动选择测试。回顾分析与真实下一步决策应在研究报告中分别注明。