6.11 杂环、肽与大环分子

本节把已学的相关谱用于残基内部、残基之间和大环构象三个层面。先保留非交换碳连氢的可靠指认，再寻找可观察的 NH 网络，最后用连接和空间资料检验整体候选。Claridge（2016）与 Nowick 的课程讨论有机分子中相关谱和交换的应用；蛋白质的顺序指认思路可参考 Wüthrich（2002）的原始研究回顾，但小肽的实验选择还取决于浓度、标记和谱峰分散程度。

NH 的可见性受与溶剂交换、氢键、温度及脉冲序列影响。在含水样品中，水抑制可同时影响与水交换的 NH，宽峰又可能低于检出限。若希望保留酰胺氢证据，不能先无条件采用纯重水并期望所有 NH 都保留下来；若已经做氘交换实验，应登记交换前后的对应变化及观察时间，而非只保存最后一张缺峰的谱。

天然丰度氮相关实验可能灵敏度不足，某个氮相关交叉峰缺失时应先检查实验能否在当前样品上检测该路径。对于已富集的肽或蛋白质，氮维度可以显著增加分散；对少量未标记有机杂环，则可能优先采用碳连氢网络、碳谱和经优化的长程相关。增加维度与提高可用信息量并不总是同时发生。

以未取代吡啶的连接骨架核对：五个环碳各带一个氢，氮没有碳连氢，总式为 \(\mathrm{C_5H_5N}\)，不饱和度四，与一个环和三组形式上的双键相容。在通常的各向同性非手性条件下，2、6 位相对应，3、5 位相对应，4 位独立，因此可从三类氢环境开始检验，而非预设五个峰。质子化后，环上五个氢仍需逐一计入，新增的氮连氢能否观察取决于交换；环氢的位移改变不能被解释为原有氢数增加。加入不对称取代基后，原来的环境对应则需要重新检查。

以组氨酸侧链的咪唑环为概念例。其酸碱变化与中性互变体分布均会影响环上氢、碳和氮的谱参数。若不同状态快速互变，常规观测可能给平均值；较慢时可能有分开或变宽的信号。要说明原子编号指的是固定原子身份，质子可占据哪个氮，则另外用状态标签记录，避免每次画互变体都交换两个氮的名称。

Platzer、Okon 与 McIntosh（2014）在端基封闭三肽中测量可电离氨基酸的酸碱依赖位移，提供了多核参照，也指出局部和整体构象改变可以产生位移变化。实际样品的一个环氢向低场移动，可能与质子化、近邻电场或构象有关，不能只套一张位移表就命名氮状态。多个报告核是否随同一滴定过程变化，是检验简单模型的有用依据。

实验设计中，逐次调节条件时应尽量控制浓度、离子强度和温度，确认样品未沉淀或分解。若使用重水体系，记录电极读数及采用的校正规则，不把未说明的读数与另一体系的数值混合。简单单一酸碱平衡的拟合只在相应条件下有效；耦合电离、结合和构象变化可能要求更复杂的模型。第7章将展开滴定和结合分析。

用明确的教学候选 Ac–Ala–Gly–Ser–NH₂ 核对总量。Ac 表示乙酰端基。三个残基的 α 位共有 \(1+2+1=4\) 个碳连氢；丙氨酸侧链提供三个，丝氨酸侧链提供两个，乙酰甲基另提供三个，碳连氢合计十二个。三个主链酰胺 NH 加末端酰胺 NH₂，共五个氮连氢；丝氨酸 OH 再提供一个，总氢十八个。交换氢的实测积分不一定达到这个理论总量。

碳数为乙酰的二、丙氨酸的三、甘氨酸的二和丝氨酸的三，合计十。三个残基氮加末端酰胺氮得四个氮，四个羰基氧和丝氨酸羟基氧得五个氧，故候选分子式为 \(\mathrm{C_{10}H_{18}N_4O_5}\)。不饱和度 \((2\times10+2+4-18)/2=4\)，与四个羰基相容。该算术结果可以核验，却不能区分改变残基次序后的所有候选。

顺序判断需寻找跨残基信息。在可适用的构象与实验条件下，前一残基的 Hα 与后一残基 NH 之间的空间相关可支持相邻关系；长程相关也可帮助把某个 NH 联系到前一残基羰基。空间接近本身不保证序列相邻，折叠后的非相邻位点也可能靠近。应检查一系列相容的跨残基联系，并与已知合成顺序、端基、质量及其他连接证据共同判断。

重复残基会造成多套相似内部网络，甘氨酸的两个氢也可能不等价。应按残基编号而非氨基酸名称登记，例如 Ala1 与 Ala4 分开，Hαa、Hαb 保留对应关系。跨残基交叉峰有多种归属时可建立候选顺序表，列出每条证据能排除的排列，避免用谱峰位移的先后顺序代替肽链顺序。

可以选择几个已指认的非交换报告核，检查主、次峰组的积分比是否一致，以及温度变化时是否按对应关系展宽或合并。EXSY 可补充状态间的交换联系，但需按照第6.8节排除空间传递等混淆。合并成一套峰仅说明在当前条件下状态不再分别可见，不证明分子只有一个几何，也不证明较弱连接异构体被热处理消灭。

对含脯氨酸的肽，要特别注意该残基主链氮通常没有 NH，沿 NH 起点追踪的流程会在这里中断。可以使用其碳连氢网络、长程联系及其他跨残基资料继续指认。缺少预期 NH 不应自动产生“序列少了一位”的结论。其余残基若发生 N-甲基化，也需要在成键计数中明确相应 NH 被替换，而不是等到看不到峰后临时删掉。

例如教学两状态的对应甲基积分为 0.9 与 0.3，归一后分别占 75% 和 25%。另一对对应 CH 若积分为 0.30 与 0.10，则支持相同分布；若为 0.30 与 0.30，需检查重叠、采集偏差或状态归属。所有核对共同描述一个样品，不能为每个峰组各设一套比例来保住转动异构体解释。

逐段完成内部指认后，可以把环拆成重叠片段检验局部耦合，再让全部片段共同接受空间约束。若只能找到解释某些 NOE 的几何，却不能解释其他可靠观测，应检查构象遗漏和指认错误。长混合时间的自旋扩散、甲基贡献和交换都会影响空间相关；对高度柔性大环，直接把全部有效距离拼进一个静态模型的风险更大。

溶剂改变可能改变氢键竞争、缔合与构象占比，浓度改变也可能影响分子间作用。若两种条件的谱图不同，应先确定哪些变化来自状态分布，哪些来自样品成分或化学反应。不同溶剂下的 NOE 与 J 不应无说明地放进同一个系综拟合。报告一个构象比例时，要保留它对应的温度、溶剂与模型。

实验选择应针对当前歧义：NH 消失时检查交换和氮相关条件，残基重叠时增加可用异核分散，顺序未知时寻找跨残基连接，状态重复时使用温度和交换资料。信息不足时保留不能区分的候选。下一节将把这些原则整理为结构修订流程，练习设计能使相似候选产生不同预测的实验。