6.2 NOE 的物理基础

先考虑能分别选择的两个氢核，记作观察核 \(I\) 与被扰动核 \(S\)。连续照射使 \(S\) 的上下自旋布居差减小，称为饱和(saturation)。达到稳态 NOE(steady-state NOE)后，可以用有照射与无照射时 \(I\) 信号的积分比较增强因子：

这里 \(A_I^0\) 是参考实验的积分，\(A_I^{\mathrm{sat}}\) 是饱和 \(S\) 后的积分，二者须采用相同接收增益、处理及积分边界；\(\eta_I\) 无量纲。这个定义规定正值表示增强。实验相位造成的图上正负峰，以及二维谱相对于对角峰的符号，另需按脉冲序列定义，不能混用。脉冲扰动后，在纵向演化期间观察磁化增长，则属于瞬态 NOE(transient NOE)；两类实验测得的量不相同（Claridge, 2016）。

NOE 不要求 \(I\) 与 \(S\) 之间有可分辨的标量耦合。分子折叠后，连接图中相隔多键的氢也能在空间中靠近；反过来，沿键连接相近的两个氢未必有强 NOE。解释时应先完成信号指认，再把相关放回三维候选结构。只有峰位置相近，没有扰动和对照实验，不能称为 NOE。

在各向同性溶液中，分子不断转动，偶极相互作用的取向平均可为零，因而通常不以静态偶极裂分出现在高分辨氢谱中。但瞬时相互作用仍在涨落。涨落会驱动自旋态之间的跃迁，改变布居与纵向磁化。这解释了为何一种在通常溶液谱中没有直接裂分的相互作用，仍能通过弛豫留下空间信息（Neuhaus and Williamson, 2000）。

旋转相关时间(rotational correlation time)描述核间向量取向相关性衰减的时间尺度。本节的 \(\tau_c\) 特指二阶取向相关时间。设单位核间向量为 \(\hat{\mathbf r}(t)\)，用 \(C_2(t)=\langle P_2[\hat{\mathbf r}(0)\cdot\hat{\mathbf r}(t)]\rangle\) 度量取向相关，其中 \(P_2(u)=(3u^2-1)/2\)，尖括号表示平衡系综平均。对刚性、各向同性、单一旋转扩散模型，归一化的 \(C_2(t)\) 满足：

\(t\) 与 \(\tau_c\) 的单位均为秒，\(\omega\) 为角频率，单位为 \(\mathrm{rad\,s}^{-1}\)。本节定义的谱密度(spectral density) \(\mathcal J\) 的单位为秒，且已经将空间振幅提出；不同文献的谱密度可能吸收常数因子，公式不能直接拼接。这里用书写体 \(\mathcal J\) 与标量耦合常数 \(J\) 区分。单指数是假设，不是相关时间的一般定义；柔性链段、各向异性转动或多种运动可产生多时间尺度的相关函数。

\(\rho_I,\rho_S\) 是自弛豫速率(auto-relaxation rate)，\(\sigma_{IS}\) 是交叉弛豫速率，单位均为 \(\mathrm{s}^{-1}\)。\(\rho_I\) 可包含多个弛豫通路；耦合弛豫时，观测恢复曲线未必是单指数，不能不加判断地把它等同于一条拟合曲线的 \(1/T_1\)。式中的负号规定了本节 \(\sigma\) 的符号。多核体系要把矩阵扩展，其他核不能都当作不存在。

对两个氢核，进一步假设刚性距离、各向同性转动、偶极机制，且两核 Larmor 角频率相对于主频率很接近，取 \(\omega_I\simeq\omega_S\simeq\omega_0\)。令 \(q=b(r)^2/10\)，它的单位为 \(\mathrm{s}^{-2}\)，则有：

\(R_{\mathrm{leak},I}\) 表示模型中未经这一个核对传递的附加纵向弛豫。近似的零频率项来自两核频率差的跃迁，二倍频率项来自频率和的跃迁；这两种同时改变两核布居的过程对交叉弛豫贡献符号相反。附加通路会改变稳态增强，即使目标核对的距离完全不变（Zhou, 2019）。

令 \(x=\omega_0\tau_c\)。在本模型中，\(\sigma_{IS}/(q\tau_c)=6/(1+4x^2)-1\)。快速转动时 \(x\ll1\)，交叉弛豫为正；随运动变慢，它经过零点，再成为负值。零点为 \(x=\sqrt5/2\)。以教学设定的 \(500\ \mathrm{MHz}\) 主频率计算，\(\omega_0=2\pi\times500\times10^6\ \mathrm{rad\,s}^{-1}\)，对应 \(\tau_c\approx0.356\ \mathrm{ns}\)。这是两核模型的抵消条件，不能据此给所有分子规定一个相同的 NOE 消失时间。

若 \(S\) 被完全饱和，\(\Delta M_S=-M_S^0\)，令式（6.2-3）的第一行导数为零，可得 \(\eta_I=(\sigma_{IS}/\rho_I)(M_S^0/M_I^0)\)。对同核单氢核对，平衡磁化之比近似为一。极快运动且只有这一核对的偶极弛豫时，\(\sigma_{IS}=5q\tau_c\)，\(\rho_I=10q\tau_c\)，故稳态增强为 \(0.5\)。距离因子在比值中消去；这说明理想稳态百分比本身不是距离刻度。实际分子的其他核与附加弛豫还会改变分母。

需要保留的完整关系是 \(\sigma_{IS}=K_{IS}r_{IS}^{-6}\)，其中 \(K_{IS}\) 包含频率与运动谱密度；若距离用米，\(K_{IS}\) 的单位为 \(\mathrm{m}^6\mathrm{s}^{-1}\)。两个核对只有在 \(K\) 可视为相同时，速率比才只反映距离比；刚性骨架上的核对与快速转动的甲基之间，不能自动使用同一个 \(K\)。

从瞬态数据提取速率时，可采用初始速率近似(initial-rate approximation)。令起始时只有 \(S\) 的纵向磁化被扰动，且 \(\Delta M_I(0)=0\)。式（6.2-3）立即给出 \(d\Delta M_I/dt|_0=-\sigma_{IS}\Delta M_S(0)\)。这一步尚未受到 \(I\) 自身磁化衰减的影响。实验需用多个短时间点寻找初始线性区，而不能把“短”规定为对所有样品相同的毫秒数；增加时间后弯曲的增长曲线已包含更高阶演化（Macura and Ernst, 1980）。

考虑一个教学设定：同一刚性片段上，参考核对距离 \(r_{\mathrm{ref}}=2.50\ \mathrm{\mathring A}\)，初始速率大小为 \(0.080\ \mathrm{s}^{-1}\)；目标核对为 \(0.020\ \mathrm{s}^{-1}\)。每个信号都对应一个氢，且起始扰动已归一化，选择效率与谱密度因子相同。在 \(0.05,0.10,0.15\ \mathrm{s}\) 的初始近似下，参考转移量分别为 \(0.004,0.008,0.012\)，目标为 \(0.001,0.002,0.003\)。转移量定义为 \(|\Delta M_I|/|\Delta M_S(0)|\)，均无量纲；这些数值是设定的线性模型数据。

计算先求速率比，再开六次方根，最后乘参考距离。速率相差四倍，距离只相差约一点二六倍。开根降低了随机强度误差的影响，却不能消除错误指认、运动因子不一致或参考距离错误造成的偏差。信号若包含多个等价氢，应把各核对的贡献按检测与扰动方式求和，避免把甲基总积分直接当作单一核对速率。

\(p_k\) 是构象 \(k\) 的无量纲布居分数，\(r_k\) 是该构象中的核间距离，\(r_{\mathrm{eff}}\) 为有效距离；距离必须统一单位。这个有效距离一般不同于算术平均距离。仅有快速构象交换不足以保证式（6.2-6）成立：内部运动也可能改变取向相关函数，此时要回到偶极涨落的时间相关模型，不能把所有动态因素都放进一个固定常数。

取另一教学设定：某核对在占比 \(90\%\) 的构象中距离为 \(5.0\ \mathrm{\mathring A}\)，在占比 \(10\%\) 的构象中为 \(2.5\ \mathrm{\mathring A}\)。六次方加权和为 \(0.9/5^6+0.1/2.5^6=0.0004672\ \mathrm{\mathring A}^{-6}\)，故有效距离约为 \(3.59\ \mathrm{\mathring A}\)，而算术平均为 \(4.75\ \mathrm{\mathring A}\)。短距离构象虽只占十分之一，却贡献约 \(88\%\) 的加权和。观察到较强空间相关，仍可能来自少量紧凑构象。

Jones 等以柔性小分子 4-丙基苯胺研究 NOE 距离与构象分析，采用瞬态初始速率条件及参考校准，并把等价核对与构象布居纳入比较（Jones et al., 2011）。这一案例说明定量解释可以实现，也说明必须保留校准和平均的假设。用一个有效距离反推多个构象的布居，通常有多组解；需要其他核对的 NOE、已学的耦合信息及几何可行性共同约束。

缺少 NOE 也不能单独证明距离远。式（6.2-4）的正负贡献可能接近抵消，其他弛豫可能降低可测变化，选择性照射可能不充分，重叠与差谱处理还可能掩盖弱信号。可见距离范围随运动、场强、实验时间和灵敏度改变，不存在一条对所有条件有效的固定距离截止线。用不同条件复核时，应记录温度、溶剂、浓度、场强以及演化时间，并检查聚集或分子间接触的可能性。

实际判别可从两个已知连接结构的立体候选开始。先列出各候选在允许构象中预测的近距离核对，选择两者预测不同且信号可分辨的一对做实验；再检查另一个独立核对及耦合信息是否一致。若候选乙只有某个低布居折叠构象能解释相关，就应估计该构象贡献并测试其他预测，而不能立即排除乙。结论可以报告为“现有 NOE 更支持候选甲，乙仍需用第二组相关检验”，同时给出用于判断的信号标签与实验条件。

镜像结构保留所有核间距离。在普通非手性介质中，用这些距离约束不能区分一对对映体，也不能单独给出绝对构型。完成本节的证据记录时，分别写下观察到的变化、采用的运动及弛豫模型、满足约束的候选，以及仍待检查的相关。后续实验应针对候选间的差异选择。