6.8 变温、EXSY 与线形分析

开始测量前，先确认样品在所选温度范围内保持溶解、稳定且密闭条件适宜。温控气流的设定值与样品实际温度可能有差别，动力学分析应使用经校准的样品温度，并记录校准方法及平衡等待。每个温度点检查不参与目标交换的信号、溶剂和基线，尽量保持可比的激发与处理条件。温度改变后重新匀场可能必要，不能把全谱普遍变宽作为局部构象交换的证据。实验操作应遵循所在实验室的仪器流程。

对可逆的两状态 A、B，保留前节 (k_{AB})、(k_{BA}) 与 (k_{\mathrm{ex}}=k_{AB}+k_{BA}) 的约定。在平衡且没有其他出口时，(p_Ak_{AB}=p_Bk_{BA})。若两状态各有可独立积分且单位核响应可比的报告信号，慢交换谱可以估计状态占比。对于同一分子内的两个构象，这个比例描述分子处在哪个构象；它不能解释成分子中两类原子的数量发生变化。若报告区域重叠、弛豫响应不同或小峰低于检测能力，比例的误差须另行估计。

式中 (K) 是此两状态模型的无量纲平衡常数，(R) 是摩尔气体常数，(T) 用 K，\(\Delta G_{B-A}\) 用 \(\mathrm{J\,mol^{-1}}\)。这里是同一分子的状态平衡，若涉及缔合或不同分子数的反应，还须写清标准态与浓度条件。平衡差描述 B 相对 A 的稳定程度；越过过渡态的能垒则决定转换速度。两个状态可以等占比而互换很慢，也可以占比差很大却互换很快。

可以把一组变温观察整理为检验过程：在低温能分开 A、B 时，对每个报告核记录两列位移与比例；温度升高时跟踪原子标签，避免按峰的左右位置重新命名。若两个区域的比例同步改变，可能支持同一个全分子平衡；若只有一个区域异常，应检查重叠与局部过程。最后回到起始温度，比较完整谱与原谱是否恢复。不能恢复时，溶剂损失、沉淀或分解都可能参与，整组数据不能继续按单纯可逆构象模型解释。

常见质子 EXSY 与 NOESY 使用相同类型的脉冲实验，名称强调其分析任务。交叉峰既可能来自同一核的环境交换，也可能来自不同核间的偶极交叉弛豫。判断前先完成原子指认：属于两个构象的同一个氢，应与整套构象信号的对应关系相容；空间 NOE 则连接不同核的位置。必要时结合选择性一维实验、ROESY、温度变化和多组报告核，检验这些解释。峰的相位可作辅助依据，但相位处理、分子运动范围和传递伪影会改变观察，不能只凭一个颜色宣布交换。

一次 EXSY 实验给出一个混合时间的传递结果。若目标是求速率，应采集多个混合时间，包括接近零的参考，比较交叉峰增长和对角峰衰减，检查是否符合一个共同的动力学模型。长混合时间可提高某些交换峰的可见性，同时加大弛豫损失和间接传递。定量时使用经过基线和重叠检查的峰体积，重复测量评估误差。仅有一张高对比度等高线图，尚不足以反演两个方向的速率。

本节把 \(I_{AB}\) 定义为先在 A 编码、后在 B 检测的峰体积，\(I_{AA}\) 为对应对角峰。二者在所设模型中带有相同的初始占比、尺度因子与 \(e^{-R_1t_m}\) 衰减，取比值时这些共同因子消去，得到：

这里 \(t_m\) 用 s，\(0\le r<1\)，返回的 \(k\) 是单向速率，仍须乘二才是总交换速率。此关系来自本节假设下的概率模型，并非任意 EXSY 谱的通用公式。不同 \(R_1\)、不等占比、NOE、非选择性激发或第三状态会破坏共同因子的消去；真实数据应使用带弛豫和交换项的磁化传递矩阵，联合拟合对角峰与交叉峰。

教学设定：在 \(t_m=0.100\ \mathrm{s}\) 时测得已经正确归属的体积比 \(r=0.197375\)。先代入比值式，\(\ln[(1+r)/(1-r)]\) 约为 0.400，得到 \(k=2.00\ \mathrm{s^{-1}}\)，\(k_{\mathrm{ex}}=4.00\ \mathrm{s^{-1}}\)。再把同一速率用于 0.050 s，预测比值约 0.099668；用于 0.200 s，预测约 0.379949。第二、第三个时间点提供模型检验，如果偏差远超积分误差，不能只保留第一个点的结果。

短混合时间下，交叉传递概率近似为 \(kt_m\)，这使增长初始斜率容易与单向速率关联；时间很长时，比值趋向一，速率差异在比值上变得很小。即使实验峰仍很强，这一饱和区域也未必能精确确定速率。选择时间点时要兼顾初始增长、足够的交叉峰信噪比与弛豫损失，不能只重复最显眼的长时间谱。误差估计也应重新考虑这个非线性变换：比值接近一时，小的积分误差可被对数反演明显放大。

可以从交换很慢的低温谱估计静态位移和耦合，但低温值未必等于合并温度下的静态值。应利用有依据的温度趋势或联合数据约束它们。处理窗函数也会改变线宽，模拟比较需使用相同处理作用，或明确把它计入模型。每个温度点可允许合理的振幅、相位和基线参数，避免仪器变化被迫解释为动力学；同时不能给每一点任意曲线，使交换参数失去约束。

参数相关是这类分析的实际困难：未知静态频率差、占比和内禀线宽，可能与速率相互补偿。应检查不同初值是否收敛到同一解释，比较多个报告信号，报告参数不确定度和残差。若数据只包含一个很窄的快交换峰，往往无法同时确定所有参数；EXSY、独立弛豫测量或更宽温度范围可以增加约束。软件返回一个数值只说明优化程序结束，尚未检验参数是否被数据确定。

\(k_B\) 是 Boltzmann 常数，\(h\) 是 Planck 常数，\(R\) 是气体常数；右侧对数内为无量纲比值。注意这里用的是对应方向的速率，并非 \(k_{\mathrm{ex}}\)。若把总速率代入对称两状态的单向式，所得能垒会降低 \(RT\ln2\)。采用其他传递系数、状态简并或不同标准态时，应说明能垒定义随模型怎样变化。

例如，教学设定 \(T=298.15\ \mathrm{K}\)、\(k_{AB}=2.00\ \mathrm{s^{-1}}\)，代入常数得到 \(\Delta G^{\ddagger}_{A\to B}\approx71.3\ \mathrm{kJ\,mol^{-1}}\)。这是一点温度下、指定模型的活化自由能，不能据此分别确定活化焓与活化熵。只有在适当温区内取得多个可靠速率，并有理由近似把活化焓和熵视为常数时，才可用 \(\ln(k/T)\) 对 \(1/T\) 的关系分别估计它们；拟合斜率的不确定度通常比单点自由能更敏感。