6.9 柔性分子与构象系综

本节沿用前两节的交换条件：当对应环境在适当的 NMR 时间尺度上快速互变，通常观察到平均参数；足够慢时可以分别观察构象信号，并用交换实验连接它们。不能由“一套峰”推断“只有一个构象”，也不能由多套峰立即认定存在多种连接异构体。先明确状态之间的变化是否只涉及构象，核对逐峰对应、积分总量与温度响应，再选择平均或分状态的分析。

设候选构象编号为 \(c\)，其占比为 \(p_c\)。每个占比非负，总和为一。在热平衡及定义一致的构象自由能下，可以用 Boltzmann 权重表示分布：

\(G_c\) 是所用条件下每摩尔构象自由能，\(g_c\) 表示尚未计入自由能的简并数，\(R\) 为气体常数，\(T\) 用 K。若计算的自由能已包含相应简并，就不再重复乘 \(g_c\)。实际构象往往是一片有宽度的自由能区域，离散模型只是计算近似；构象搜索得到的几何个数，不等于它们在样品中的实际占比。

溶剂和温度影响相对自由能，也影响氢键、缔合及各构象的谱参数。晶体中的几何可以提供一个候选，却受到晶格与分子间作用约束，不能直接给出溶液占比。第8章将讨论构象搜索和计算位移；这里先使用明确标注的教学参数，理解怎样让一个系综同时接受多种实验检查。

占比预测对自由能差很敏感。两个不简并状态在 298 K 相差 \(RT\ln3\)，就产生约 3:1 的权重；若计算误差与这个差值相当，给出很多位小数的占比没有相应准确度。构象搜索也可能遗漏稳定几何，或把同一几何的小扰动重复计作许多状态。应去除重复、检查能量范围与溶剂模型，再以实验约束修正合理的分布。自由能、纯电子能和优化程序的目标函数数值具有不同含义，不能任意选择最便利的一列来计算权重。

教学设定：只考虑构象 A、B，对一个已指认三键路径采用 \(J(\theta)=12\cos^2\theta\ \mathrm{Hz}\)。A 的二面角为 180°，故 \(J_A=12\ \mathrm{Hz}\)；B 为 60°，故 \(J_B=3\ \mathrm{Hz}\)。观测平均耦合为 5.25 Hz 时，\(12p_A+3(1-p_A)=5.25\)，得到 \(p_A=0.25,p_B=0.75\)。角度的算术平均恰为 90°，简式在 90°给零，不能复现 5.25 Hz。二面角具有周期性，跨越角度边界时连算术平均角度本身也须谨慎。

这一反演仅在两个候选构象的耦合已知且互异时给出一个占比。若再加入构象 C，同一个平均值通常允许多组占比。即使限定两个构象，预测耦合的误差也会传到占比上：A、B 的耦合相差很小时，测量的小误差会导致占比的大变化。应使用几条对构象变化有不同响应的路径，确认一个共同分布能解释所有观测。

例如，另一条独立耦合路径在 A、B 中分别为 2 与 10 Hz。刚才的占比预测该路径为 \(0.25\times2+0.75\times10=8.00\ \mathrm{Hz}\)。若实测可靠值为 5 Hz，当前两构象模型不相容；可能原因包括候选几何遗漏、Karplus 参数不适合或耦合读取受二阶效应影响。不能为每一条耦合另拟合一套占比，却仍将它们称为同一个样品系综。

平均式还要求比较的是同一个核对。若在不同构象中交换了 H3a、H3b 标签，两个不同耦合就可能被错误地平均在一起。实验多重峰中任意两谱线的间隔也不一定是可平均的 J；强耦合时应先用自旋系统模型提取参数。中间交换范围更需同时处理交换与相干演化，不能把宽峰的视觉间隔套入静态平均式。选择报告路径时，优先采用指认清楚、能够可靠测得耦合且对候选构象有区分能力的核对。

\(r_c\) 是同一对核在构象 \(c\) 中的距离，所有距离须使用相同单位。该式不是一般意义的平均距离；如果相关时间、内部运动或完整弛豫网络不能约去，应使用更完整的模型。Jones、Butts 与 Harvey（2011）以柔性小分子研究这种平均与 NOE 距离分析，说明定量解释必须同时检验测量条件和构象描述。

教学算例：A 占 10%，核间距离 2 Å；B 占 90%，距离 5 Å。直接平均距离是 4.7 Å，但 \(0.1/2^6+0.9/5^6=0.0016201\ \mathrm{\mathring A^{-6}}\)，所以有效距离约为 2.918 Å。A 对这个简化 NOE 权重的贡献约为 96.4%。较少的紧凑构象因此可能主导某一接近信号，不能把强 NOE 一律解释为“主要构象里两氢很近”。

距离参照同样须检验。若用一个已知核对将 NOE 强度换成距离，该参照核对的内部运动、弛豫条件和激发方式应与待测核对具有足够可比性。甲基包含多个氢，转动及多个距离贡献不能简单当作单一核对处理。定量分析需记录怎样合并这些贡献。对只有交叉峰有无的资料，可以先作定性的空间相容检查；不要从未做强度定量和运动分析的等高线图中报出三位小数的距离。

为避免因实验记号造成系数混淆，本节把额外加入所测耦合分裂的那部分定义为 \(D\)，相应 \(T=J+D\)。在相容的各向同性和取向样品中分别测 \(J\) 与 \(T\)，才可提取这个定义下的 RDC。有些文献把偶极 Hamiltonian 系数记为另一种 D，并写总分裂为 \(J+2D\)，使用时应先转换约定。模型中还须有取向张量(alignment tensor)或等价的取向分布描述，不能把一个 RDC 数直接翻译成唯一键角。

残余化学位移各向异性(residual chemical shift anisotropy, RCSA)则保留部分化学位移张量的取向贡献，对无氢碳等位点也可增加结构信息。Nath 等（2016）的原始研究展示了这种相对构型分析。提取 RCSA 需校正取向前后由浓度、温度和介质引起的各向同性位移改变，不能把任何加入取向介质后的位移差都归为 RCSA。

柔性分子的内部变化与整体取向可能相关，各构象不一定共用同一个张量。Tzvetkova 等（2019）讨论并研究了这种构象与取向分析问题。只有少数取向数据时，复杂系综可能存在多解；不同候选应采用可比的模型自由度，检查独立数据或另一取向介质，而非仅比较已用于拟合的数据误差。普通非手性取向介质也不会自动消除整体镜像歧义。

固定刚性几何时，一个对称无迹的取向张量有五个独立分量。有限数量的 RDC 可能主要用于确定这五个分量，剩余能够独立检验结构的约束很少；核间向量方向接近时，数据还可能近似相关。增加测量数量需要同时增加方向覆盖。柔性模型若给每个构象独立张量，会再增加自由度，所以更小的拟合误差必须结合信息量判断。取向介质还可能改变构象平衡，应比较各向同性与取向样品的常规参数，检查是否可以采用同一系综。

“构象 A 占比约四分之一”应附条件、候选集合和误差，不能改写为分子始终采取 A。需要说明哪些数据能够排除其他构型，哪些只限制当前构型内部的分布。对于糖类、天然产物和大环，这一区分会直接影响后续立体指认；保留系综记录，才能在补充新实验后重算，而不用重新猜测原有图中的姿态。

在实际指认表中，可给每个观测保留测量条件、实验误差和模型预测误差三列。温度改变后的参数不能无说明地与另一温度的 NOE 合并成同一个分布。某些结论只要求排除一个构型，某些结论则要给出细致占比，后者通常需要更丰富的数据。根据任务报告足够的细节，仍未确定的占比区间保留原始范围，以便下一次增加报告核或改换介质时继续比较。