6.3 NOESY 与 ROESY

核 Overhauser 效应谱(nuclear Overhauser effect spectroscopy, NOESY)在演化时间内给磁化编码化学位移，在混合时间(mixing time)内允许磁化转移，再检测接收信号的频率。以氢A为起点、氢B为接收端的转移，出现在横纵坐标分别对应B与A的位置。常规NOESY的混合阶段主要保存纵向磁化，因此利用实验室坐标系中的交叉弛豫(cross-relaxation)。坐标表示转移前后两个共振频率，峰形与强度还包含脉冲、弛豫和处理的影响（Claridge，2016）。

旋转坐标系 Overhauser 效应谱(rotating-frame Overhauser effect spectroscopy, ROESY)在混合阶段用射频场维持横向磁化，这一步称为自旋锁定(spin locking)。磁化相对于射频场的弛豫产生旋转坐标系NOE，通常简称ROE。早期四糖结构研究展示了旋转坐标系的瞬态效应（Bothner-By et al.，1984）；Bax与Davis（1985）讨论了ROESY的实验实现。图 6.3-2只画出编码、混合和检测的功能区，不作为可直接运行的脉冲程序。

一对可靠相关通常在对角线两侧出现对应交叉峰。配对、重复采集和改变等高线阈值有助于检查拾峰，但对称性本身不能证明空间接近：交换也会产生配对交叉峰，强对角峰的拖尾可能落入邻近区域。判断时应看二维峰形、切片和噪声位置；不能把一条切片中所有起伏都登记成相关。

采用单一相关时间、各向同性整体转动、刚性同核氢对和偶极弛豫模型，可把谱密度与交叉弛豫率写成下式。为避免把简化模型当作所有分子的通式，常数因子并入正的\(K\)；忽略两个氢之间相对很小的化学位移频率差。这一写法与NIH的完整弛豫矩阵文档相符（NIH，2013）。

\(\Omega\)是取向涨落被采样的角频率，\(\omega_0\)是氢的拉莫尔角频率，单位均为\(\mathrm{rad\,s^{-1}}\)；\(\mathcal J\)在此归一化下单位为秒，沿用6.2节的书写体记号，与标量耦合常数\(J\)区分。\(r_{AB}\)为核间距离，\(\sigma_{AB}\)单位为\(\mathrm{s^{-1}}\)；若距离用米，\(K\)具有相应的\(\mathrm{m^6\,s^{-2}}\)单位。取A的编码磁化为正、B的初始编码磁化为零，B最初的增长率带有交叉弛豫项的负号：

\(\Delta M\)表示带有频率编码的磁化偏离量，\(\rho_B\)为B的纵向自弛豫率；\(C_{BA}\)为按初始A磁化归一化的转移系数。快速转动时，两个谱密度接近，\(\sigma_{AB}\)为正，所以NOESY直接交叉峰与正对角峰相反。慢转动时，低频项占优，\(\sigma_{AB}\)变负，交叉峰与对角峰同号。Macura与Ernst（1980）讨论的短、长相关时间极限正对应这种相位变化。这里的“负交叉峰”可对应选择性饱和实验中的正NOE增强；前者是二维转移系数的符号，后者是饱和前后信号变化的符号。

令\(x=\omega_0\tau_c\)，式6.3-1的符号取决于\(6/(1+4x^2)-1\)。零点满足\(x=\sqrt{5}/2\)。在标称500 MHz氢频率下，以\(\omega_0\approx2\pi\times500\times10^6\ \mathrm{rad\,s^{-1}}\)代入，得到\(\tau_c\approx0.356\ \mathrm{ns}\)。这个数值是简化模型的计算结果，不能直接换成一个固定分子量界限。近零区中，即使A、B很近，NOESY也可能没有可检出的直接峰。

在通常的同核、各向同性运动模型和适当自旋锁定条件下，直接ROE没有上述常规NOE的零点，交叉峰与对角峰相反。ROESY因此适合补查NOESY近零区；它的峰强仍受锁定效率和弛豫影响，不能与另一张NOESY的峰强直接比较（Bax与Davis，1985）。

对强耦合、明显失谐或混合转移过程，表6.3-1的简单相位分类需要进一步检查。

选择实验时，可先用已经指认、预计接近并且信号分离的一对氢检查是否有直接相关。若NOESY接近噪声而ROESY出现稳定异号峰，结果与NOE近零区相容，但仍需检查锁定伪影。若所有相关均弱，先检视线宽、重叠和处理，不能仅据缺峰推断分子属于某个大小区间。两张谱均出现可靠相关时，可用它们的相位与增长规律互相核对；距离计算仍各自使用相应实验的标定条件。

下面给出教学设定的数据，均为已排除交换与接力、各代表单个氢的直接相关。参照氢对R的距离已知为\(2.50\ \mathrm{\mathring A}\)，待估氢对X与R具有相同的运动谱密度。令\(q(t_m)=|V_{\mathrm{cross}}(t_m)|/V_{\mathrm{diag}}(0)\)，其中\(V\)为已校正响应的峰体积。表6.3-2采用初始线性模型生成，数值不来自实测谱。

先把毫秒换成秒，参照斜率为\(s_R=0.016/0.020=0.80\ \mathrm{s^{-1}}\)，待估斜率为\(s_X=0.002/0.020=0.10\ \mathrm{s^{-1}}\)；另外两个时间点给出相同结果。由相同运动条件下\(s\propto r^{-6}\)，求比值时谱密度和比例常数消去：

斜率相差八倍，距离只相差约1.41倍。真实数据中应同时报告斜率拟合的不确定度和参照的来源；这一计算也依赖氢对的运动是否可比。甲基快速转动、多氢重叠、不同局部柔性及不适当的归一化会破坏简单比例。若只有一张长混合时间谱，体积比还混入自弛豫和接力项，不能直接套用式6.3-3（NIH，2013）。

自旋扩散(spin diffusion)指磁化经多个交叉弛豫步骤传播，例如A先传到B，再传到C。A与C没有显著直接转移，也可在较长混合时间出现A—C交叉峰。用弛豫矩阵\(\mathbf R\)表示所有自弛豫与交叉弛豫，其元素单位为\(\mathrm{s^{-1}}\)，转移为\(\exp(-\mathbf R t_m)\)。展开后，直接项是一阶，经过一个中间氢的项从二阶开始；这里的矩阵只是记账形式，读者不必先求矩阵指数。

在图 6.3-3的教学模型中，令直接\(R_{CA}=0\)，A—B与B—C的交叉弛豫率绝对值均为\(2.0\ \mathrm{s^{-1}}\)，且同号。二阶接力幅度便为\((2.0\ \mathrm{s^{-2}})t_m^2\)。20、40、60 ms时分别为0.0008、0.0032、0.0072；时间加倍，接力项增至四倍。直接项若为\((0.8\ \mathrm{s^{-1}})t_m\)，相应幅度仅随时间加倍。高阶项、噪声和弛豫衰减会影响真实曲线，所以这种区别是诊断线索，不能把所有弯曲曲线都唯一归因为自旋扩散。

ROESY中的可疑峰若沿已知COSY或TOCSY自旋系统出现，应检查锁定条件和耦合转移；较大的射频失谐会改变有效锁定方向，造成频率依赖的响应，长时间锁定还可能改变样品温度。需要把不同锁定时间的谱与合适的序列控制相比较。NOESY也可能有零量子等相干伪影，常需从色散或反相位峰形识别。牛津NMR设施的术语指南特别提示ROESY会受TOCSY转移干扰；改变实验参数后峰消失，只能说明其依赖那些条件，尚需检查直接效应是否也被削弱。

即使获得距离估计，柔性分子中它也不必等于一个固定构象的几何距离。在谱密度可比较、构象互变可用占比平均的简化条件下，初始转移近似取决于\(\langle r^{-6}\rangle\)。因此少量短距离构象可对观察产生较大贡献。仍用教学设定比较候选P与Q：P将某氢对固定在\(3.54\ \mathrm{\mathring A}\)；Q的两个构象分别占10%和90%，距离为\(2.50\)和\(5.00\ \mathrm{\mathring A}\)。Q的有效距离为

短距离构象对括号内总量贡献约88%。若校正后的距离估计为\(3.54\ \mathrm{\mathring A}\)，其不确定度又不足以区分3.54与3.59，两候选均可能符合该项证据。有效距离也不等于普通占比平均距离；后者为\(4.75\ \mathrm{\mathring A}\)。真实分子还要考虑不同构象的运动谱密度与内部转动，不能只在几何坐标上算完平均就宣布匹配（NIH，2013）。

比较相对构型时，应提出多个独立氢对的预测，把NOE/ROE与已有的耦合、连接及构象证据合并。某交叉峰只在一个候选的已知稳定构象中预期出现，并且在其他合理构象中无法解释时，才有较强区分力。普通非手性介质中的NOESY和ROESY通常不能区分一对对映体：镜像保留核间距离，因此同一组相关不能自行给出绝对构型。具体烯烃与环系判断见6.4节，柔性系综的处理见6.9节。

实验记录应保存所用混合时间、相位约定、峰体积和候选预测，使后续实验能够针对同一组氢对复查。